有以下因素,
(1)层析柱的选择,主要是层析柱的长度对分辨率影响较大,长的层析柱分辨率要比短的高。
(2)凝胶柱填装情况将直接影响分离效果,凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
(3)洗脱液的选择,改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用,所以和其它层析方法相比,凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。
(4)加样量,加样量对实验结果也可能造成较大的影响,加样过多,会造成洗脱峰的重叠,影响分离效果;加样过少,提纯后各组分量少、浓度较低,实验效率低。
(5)洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果,一般洗脱速度要恒定而且合适。
丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵)作用下形成的凝胶。凝胶孔径大小可以通过制备时所使用的浓度和交联度控制。交联剂越多,孔隙越小。浓度越大,凝胶孔径越小
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用,它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离,在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用,一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率,改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用。
GFC是英文gel filtration chromatography的缩写,中文解释凝胶过滤层析,又称为分子排阻层析。
GFC是指在待分离的物质中,分子量大的分子无法进入凝胶颗粒网状结构的小孔穴内,它会从凝胶颗粒的间隙里通过,因此流出速度快;分子量小的分子会进入凝胶颗粒网状结构的小孔穴中穿行,因此流出速度慢。因此,GFC根据待分离物质的分子量大小不同、在凝胶内流过的速度存在差异而进行分离的。
GFC多应用于多肽、多糖、核酸、蛋白质、病毒、细胞等的分离纯化,此外,还广泛应用于生物样品的除盐和缓冲液的交换。
凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术,又称之凝胶过滤,分子筛层析或排阻层析。
凝胶柱层析的使用方法大体有一下步骤:
(1)预处理称取葡聚糖凝胶(有不同型号)若干克,加入洗脱剂(通常为甲醇或者水,这里以甲醇为例)约20倍凝胶量,置室温下3h进行溶胀,溶胀必须彻底,否则会使上柱后流速变慢,凝胶断裂等。
(2)装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15
(3)加样装好的色谱柱至少要用相当于3倍保留体积的洗脱剂平衡。
(4)洗脱与收集洗脱时,用甲醇作洗脱剂,并且要连续不断地进行,使凝胶柱上端保持一定的液层,防止凝胶柱表面的液体流干。
蛋白质的分子量不同
凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术,又称之凝胶过滤,分子筛层析或排阻层析。
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