细胞冻存时dmso的作用(细胞冻存为什么加dmso)

细胞冻存为什么加dmso

冻存的原则是：慢冻，主要是防止细胞在冷冻过程中形成冰晶，对细胞造成损害，加DMSO也是这个原理。

复苏细胞的原则是：快融。主要是防止DMSO在液体状态下对细胞的毒害作用，快速使细胞进入复苏和生长状态。

因此，细胞的冻存与复苏原则应该是慢冻快融。分别经过4度，-20度，-80度和液氮的依次过程进行冻存；经过37度水浴1分钟之内解冻细胞冻存液进行复苏。

细胞冻存的方法有哪些

细胞做成冻存管时，如果有程序降温盒，可以直接用程序降温盒于-80℃冻存，过夜转移至液氮中保存形式时。那么，没有时候怎么办呢，顺序依次降温：无菌室室温---4℃，30min(不要超过2小时）---﹣20℃，30-60min（不要超1h,减少冰晶对细胞伤害）---﹣80℃过夜（放﹣80℃最少在6h以上）---液氮保存（要定期观察液氮罐里液氮量，缺少时及时添加）

细胞冻存作用

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。

标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-E0℃之后可直接投入液氮内(-19

6℃)。

细胞冻存可以直接放在-80℃吗

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4. 离心1000rpm，5min；

5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞冻存为什么加白蛋白

步骤:

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4. 离心1000rpm，5min；

5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞冻存应注意的问题

人体冷冻是一门新兴的科学，主要研究体温对寿命的影响。降低体温的实验已经取得了良好效果。如果将人的体温降低两度，那么一个人便可以多活120到150 年。果真如此，人类就能活到700甚至800岁。但是，实验刚刚开始，所以现在向世人宣称“我们已征服了死亡”还为时尚早。

从基本的物理和化学规律，可以推导出长时间储存动物细胞，通常需要－120℃，当然－196℃更好，在这样的温度下，一切化学进程都几乎完全停滞，除非储存时间以地质时间为标尺，此时惟一的伤害来自于高能射线的，但这通常需要数百年的时间才会具有真正的威胁。数十年的研究，科学家发现，冻结和复苏动物细胞时，存在一个明显的危险温区，0～－60℃，损伤主要发生在这个温区。如何度过这个危险温区安全抵达－120℃，就是研究的重点，先让我们看看在冻结动物细胞时，可能发生的事情。

细胞的冻结，通常是从－5℃开始，这是因为细胞内外的液体都是盐溶液。当细胞内外的液体进入过冷态后，细胞外液率先结冰，这些冰基本上由不含盐分的水构成。如果降温过快，这些冰就可能突破细胞膜进入细胞，或者细胞内液也迅速开始结冰，这些快速生长的冰晶几乎一定会导致细胞膜发生严重损伤，复苏的希望就此终结。那么抗寒生物的能力从何而来？答案是甘油类抗冻物质的合成。

甘油溶液的冰点很低，当细胞外液开始结冰后，胞内液的温度还在冰点之上。而伴随着结冰的过程，外液的盐浓度开始上升，在渗透作用的影响下，细胞开始脱水，速度因细胞膜等因素的不同而有所差异。细胞体积收缩，一方面可以规避胞外的冰晶，一方面还可进一步降低胞内的冰点。所以，这些抗冻生物的细胞在自然环境的低温下，大多并没有被真正冰冻，这就有效了防止了冰晶的损伤。而这些抗冻物质的存在，还可防止细胞过度脱水收缩带来的损伤，同时使得有害物质的浓度不会上升得太高，减缓了可能的化学伤害。

但要想在数年甚至更长的时间内保存细胞，零下数十度的温度是太高了，不冻结住胞内的液体，化学损伤就无法真正避免。而冻结胞内液体的时机选择就是关键中的关键，如果一直低速降温，那么细胞就可能过度收缩，同时高浓度的胞内溶液将直接损伤细胞。所以，我们需要当细胞收缩恰到好处之时，急速降温冻结住胞内液体。而研究显示，不同的细胞，安全冻结的降温以及复苏的过程差异很大。这就是为什么，直到今天为止，器官移植中“浪费”现象非常严重，一个器官由太多不同类型的细胞构成，要长时间的安全冻存，今天的科技还无法做到。当然对低温生物学的研究，已经大幅度地延长了器官的保存时间，比如肾脏，从前离体后，必须在6小时内移植，而通过低温抗冻液体灌流术，已经可以延长到72小时，但这点时间依然太短。许多志愿捐献的器官，在突发事件发生后，根本来不及移植给任何人，就彻底地死亡。这是不是意味着，类似冬眠机这样的东西永远都只能属于科学幻想呢？低温生物学的新发现，也许可以帮助我们开辟另一条安全冻结之路。

为什么要进行细胞冻存

细胞冻存的步骤：

　　1、选择活力好，密度约80%的细胞，此时细胞处于对数生长期，比较适合冻存。细胞冻存依旧分为贴壁细胞冻存和悬浮细胞冻存。

　　2、显微镜下观察细胞状态,若细胞密度较高，培养基变黄，需要换液4h之后再进行冻存操作，细胞长满后，将培养皿中的培养基用枪小心的吸去。再用PBS冲洗一到两次,尽量吸干净润洗的PBS，加入胰酶消化细胞,消化一定要注意控制胰酶作用时间，消化细胞时由于每个细胞贴壁性不一样，消化时间差别会很大,胰酶消化是需要比较精细的操作，既要充分消化下细胞打散成单细胞悬液，均匀接种，又要避免消化过度造成细胞严重受损。大家用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的，所以不能完全规定消化时间，一般仪个人经验为准。

　　对于消化这步，建议按照下述操作：胰酶首先复温到室温后加入细胞，放入37℃培养箱，然后每隔30秒，吹打下细胞，如果能够吹打散细胞，说明细胞消化完成可以终止消化，之后混匀细胞时尽量轻柔，不要产生过多气泡。如果30秒不能分散，则再等30秒重复操作。

　　3、消化完成后加6-8ML完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液。

　　4、900-1000rpm离心3分钟，弃上清,加入配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml,在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者,装有细胞的冻存管放入-4℃冰箱10分钟 ，然后放入-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

　　5、24小时后取出一只冻存管复苏，检查活性及是否污染。

细胞冻存是用来做什么的

干冰保存就可以吧，快递公司有这种业务；之前做过把细胞复苏后，将培养瓶灌满培养液包好直接带走，不过时间不能太长。

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。

细胞冻存加多少冻存液

就是将细胞保存起来，一般细胞用细胞冻存液重悬以后，将细胞先放在-80度冰箱，过夜后可转移到液氮长期保存，理论上细胞在液氮里可以永久保存(实际上也就5-6年，所以要定期更新)，-80有的冻存液冻存的细胞可以保存2-3年。

细胞冻存有用吗?

其实是能存活的，倘若真的是冻存前污染，复苏也没得用了。复苏后过夜，若细菌污染，培养基基本混浊了；若真菌污染，换个液，再养12~24h，看看细胞形态和培养基里面是否有东西在生长。在液氮里的细菌是能存活的，在液氮里保存的细菌可以放好多年。复苏以后，细菌就会再次繁殖。最好先复苏一小部分，然后大概鉴别一下是哪类的细菌污染的，然后再在复苏其他部分时加入抗生素等方法除去被污染的细菌。

如果是细菌污染，在培养液中一天就会变混浊，真菌会在3-5天。可以将变混的培养液涂片、镜检、做一些生理生化实验简单鉴定一下。

细胞冻存为什么加血清

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，其中含有丰富的细胞生长所必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。牛血清是一种成分复杂的混合物，而且血清的组成及含量通常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而存在差异。牛血清主要成分有蛋白质，多肽类，激素类，其他成分 如氨基酸、葡萄糖、微量元素等。