pcr中dntp的作用(pcr技术中dntp的作用)
pcr技术中dntp的作用
PCR
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′-末端和3′-末端相互补的寡核苷酸片段为引物，
过程
在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸，直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP以及含有Mg2+的缓冲液。
PCR技术中的dNTP是指什么
1、DND聚合酶——又称DNA依赖的DNA聚合酶
它是以DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNA聚合酶根据聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同，有可以分为多种。在IVD领域中比较常见的酶如下：
Taq DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，从Thermus aquaticus中分离出来，是目前科研和分子诊断试剂盒里最为广泛应用的聚合酶。为了更优化PCR反应体系，Taq DNA 聚合酶被进行了一系列的性能提升和优化，其中最为熟知的就是热启动Taq酶.
热启动Taq酶：该酶被进行了化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。无论是哪种修饰，其原理都是：在反应体系加热至高温之前，Taq DNA 聚合酶活性被“修饰”抑制，进而抑制低温条件下的非特异性扩增。另外，还有一系列突变体Taq DNA聚合酶被筛选出来以满足耐镁离子、耐盐、高保真等要求。
Bst链置换DNA聚合酶——Bst DNA聚合酶是来源于 Bacillus stearothermophilus的DNAPolymerase I，经基因工程改造去除了其 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。同时，该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高，而且增加了dUTP耐受性，非常适合于防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。
由于此次新冠的影响，Bst成为IVD领域内又一个DNA聚合酶宠儿。
除了Bst外，还有其他类似功能的链置换DNA聚合酶，如如Bca best聚合酶、 Klenow聚合酶、phi29DNA聚合酶等。
Tth DNA聚合酶——Tth DNA聚合酶来自Thermus thermophilus HB8，其最有趣的现象是：在Mg2+条件下，Tth DNA聚合酶具有较强的DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下，Tth DNA聚合酶具有更强的反转录活性。这一特性使得Tth DNA聚合酶搭配相应的buffer可以同时对DNA模板和RNA模板进行扩增。
2、逆转录酶——又称为RNA依赖的DNA 聚合酶
该酶以RNA为模板，按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。最常用的逆转录酶为M-MLV和AMV。
3、RNA聚合酶——一条DNA链或RNA为模板的聚合酶
也称为转录酶。最为常见的是T7 RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。目前体外诊断中，SAT技术中会看到RNA 聚合酶的身影。如仁度、中帜的RNA扩增方法中就需要使用RNA聚合酶。
4、蛋白酶K——能够酶解样本中的各类蛋白质的酶
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)下均有活性，EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。用于质粒或基因组DNA、RNA的分离和抽提。在病毒核酸检测中，蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放以便后续进行核酸抽提。
5、UDG酶——高效控制PCR残余污染
尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶也称为尿嘧啶 -N- 糖基化酶或UNG酶。
因PCR是一种极敏感的扩增技术，易受污染的影响。小量的外源 DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。卫生部明确规定，凡是用于临床检验的PCR试剂，都应该有UNG酶技术，以防止污染。由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
UDG酶的作用原理：在PCR产物或引物中用dU代替dT或者。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
热敏性UDG: 除了常规UDG外，现在也开发出热敏型UDG，热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG，热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。
6、限制性核酸内切酶——识别并剪切特定的脱氧核苷酸序列
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
常用的酶，如BsoB I, Hinc II，Nt.BstNBI切刻内切酶。其中，BD公司的链置换扩增术(stranddisplacement amplification,SDA)等温PCR系统中选择的酶需具有切割位点专一性，且对识别位点的化学修饰敏感。新冠疫情中Abbott 的明星产品ID NOW等温PCR系统中，就采用Nt.BstNBI内切酶。
7、解旋酶，helicase——使双链DNA变成单链DNA
利用ATP水解提供的能量来解开双链DNA核苷酸配对形成的氢键，从而形成单链DNA；
常用解旋酶：大肠杆菌的UvrD和T7噬菌体的gp4；大肠杆菌解旋酶II（UvrD），其解链速度是20bp/s，对反应速度有很大的制约性。T7噬菌体的解旋酶gp4解旋酶的解链速度更快，可达400bp/s，可以大大提高反应速度。
目前，Quidel等温PCR系统HAD中采用此酶
pcr过程中dntp的作用
PCR反应体系：
1. 缓冲液
标准的缓冲液含 1pmol/ml Tris ·HCl，其 pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+。
2.dNTP
脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在内的统称，即合成新的 DNA 链的材料。4 种 dNTP 的浓度相等，总浓度一般为 200pmol/ml （即饱和浓度）。dNTP 可与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度下降，影响 DNA 聚合酶的活性。
3. 引物
引物是一段短的单链 DNA 片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA 聚合酶可由其 3′端开始合成新的核酸链。引物长度一般以 18～30bp 为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。
4. 模板
模板是一段单链或者双链 DNA，提供用于进行 PCR 扩增的原始信息。对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等。模板 DNA 应该尽量保持低温保存。
5.Taq DNA 聚合酶
Taq DNA 聚合酶以 DNA 为复制模板，从将 DNA 由 5' 端点开始复制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于－20℃，内含甘油保存。最适反应温度 72 ℃，即延伸温度。通常在配制 PCR 体系的最后加入。
pcr反应中dNTP浓度
是kb，在PCR反应中,单位kb也就是1000bp的意思 ,表示核酸长度 ,基因的单位,比如2Kb就是2000对核酸序列。
以25ul的pcr体系为例，一般用浓度是25μmol/L的dNTP 2ul, 10μmol/L的引物1ul，2.5 mmol/L Mg2+ 2ul，模版一般1ul，2000u 的酶0。5ul。buffer一般选用10x，就是稀释10倍使用，每25ul体系加10xbuffer 2。5ul。u是酶活力单位。ng就是10－9 g ；1000x μmol/L＝ mmol/L换算是x=1000 mx=1000000ux=1000000000nx x可以是g,l,mol等国际计量单位
pcr为什么用dntp
由于进行PCR试验时，往往要向PCR管中加入buffer、dNTP、DNA酶、引物、模板、水等各种PCR反应所需的试剂，而在加入这些试剂时如果操作不规范很容易造成污染，导致PCR结果不准确。
因此，为了简化反复添加各种试剂，便将buffer、dNTP、DNAPolymerase等试剂先混合到一起，即配制成Master Mix然后再使用，即简化了PCR操作步骤，也减少了污染的途经。
pcr为什么要用dntp
PCR又称聚合酶链式反应，PCR的过程可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR的三个步骤分别是1.高温变性:利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，；2.低温退火:低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；3.中温延伸:当调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。它需要DNA模板，上下游引物，taqDNA聚合酶，dNTP以及缓冲液(镁离子很重要)，当然还有超纯水。
当然现在实验室做PCR，买的缓冲液里面是直接加好聚合酶和dNTP的，可以直接用。
一般的25微升体系里DNA模板和上下游引物各1微升，PCR MIX12.5微升，ddH2O9.5微升。
pcr技术的原料中的dNTP是什么
可以简单的这么理解：因为dntp与模板稳定结合的温度是非常低的，而在一般的pcr程序中，退火这一过程的温度一般都在50度以上，这相对来说算很高的温度，是不利于dntp与模板稳定结合的！所以，结果就是几乎所有的模板都跟引物结合了，这里需要纠正一点，不是模板先跟引物结合，而是一个概率的问题，没错就类似于化学上的有效碰撞理论，dntp和引物竞争模板，就数量上来说，dntp比引物可是要多得多的，与模板发生“碰撞”的几率甚至比引物更高，但能够有效结合的“碰撞”相对于引物来说是极少的！而且结合后，由于温度很高，dntp与模板形成的氢键依然会轻易地断裂，导致dntp重新成为游离的状态！最终，退火结束时，与模板结合的就基本都是引物而不是dntp了！
因此，基于这种现象，在进行pcr时，以缓慢降温退火（比如0.1℃/s，温度跨度可以在十几二十度）代替传统的退火，可以极大地提高特异性扩增！
PCR中dNTP的作用
NTP一般指网络时间协议。 网络时间协议，是用来使计算机时间同步化的一种协议，它可以使计算机对其服务器或时钟源做同步化，它可以提供高精准度的时间
校正，且可介由加密确认的方式来防止恶毒的协议攻击。NTP的目的是在无序的Internet环境中提供精确和健壮的时间服务。
dntp是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C等中的一种。在生物DNA合成中，以及各种PCR中起原料作用。
pcr技术所用的dntp
PCR技术的基本原理pcr-t技术原理？类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。
而且这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
扩展资料：
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
