南非醉茄中醉茄内酯类化合物抗SARS-CoV-2活性的分子机制研究

2019年12月，武汉爆发了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2，席卷全球。此病毒为β类冠状病毒，其特征为膜包裹的单链RNA。这些病毒表面突起的跨膜刺状糖蛋白(S蛋白)使它们具有冠状的形态，因此得名冠状。冠状病毒进入宿主细胞后病毒糖蛋白的S1首先附着在宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)上。然后病毒进一步依赖于被称为跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)的宿主细胞蛋白酶S蛋白的启动。TMPRSS2在S1/S2和S2‘位点裂解S蛋白，促进病毒颗粒与宿主细胞膜的融合，成为SARS-CoV-2感染性和繁殖的关键因素。SARS-CoV-2还可以利用内体半胱氨酸蛋白酶CatB/L在TMPRSS2缺失的细胞中启动其糖蛋白。因此TMPRSS2被认为是治疗/预防SARS-CoV-2和其他相关感染的有希望的靶点。

病毒基因组的复制酶基因进入宿主细胞后，编码两个重叠的多蛋白，即pp1a和pp1ab。病毒复制和转录所需的功能多肽随后通过广泛的蛋白水解活性从这些多蛋白中释放出来，这种活性主要是由SARS-CoV-2的主要蛋白酶(MPRO)介导的。MPRO(也称为3C样蛋白酶)在自身从pp1a和pp1ab自我切割后，在多个保守位点切割多个蛋白。MPRO在病毒感染循环中的重要性，以及宿主细胞中缺乏与该酶同源的蛋白质，使得MPRO也成为开发抗病毒疗法的一个有吸引力的靶点。不同的人和动物冠状病毒的MPRO在一级氨基酸序列和功能三级结构上具有很高的相似性。为MPRO设计的抗病毒药物主要针对其高度保守的底物结合口袋。与其他冠状病毒相似，SARS-CoV-2在其MPRO酶中也有同样的同源性。已经报道了包括SARS-CoV-2在内的不同冠状病毒MPRO底物结合口袋不同亚位点上的几个关键的相同残基。这些保守残基主要包括His41、Tyr54、His163、Glu166、His172、Asp187和Gln192。

南非醉茄含丰富的睡茄内酯类，作者团队在前期研究中已经证实了Withaferin-A（Wi-A）和Withanone（Wi-N）都可以对接到TMPRSS2的催化位点。

图1 甲磺酸卡莫司他（Camostatmesylate）和九个睡茄内酯类化合物

在本研究中，作者检测了几个内酯类化合物的潜在作用：(I)阻断SARS-CoV-2与宿主细胞受体(TMPRSS2)的相互作用，在mRNA和蛋白水平下调TMPRSS2的表达；(Ii)与SARS-CoV-2主要蛋白酶(MPRO)底物结合位点相互作用。在所研究的化合物中，6个内酯类化合物Withaferin-A、Withanone、Withantholide-A、Withanoside-IV、Withanoside-V和MethoxyWithaferin-A在转录和翻译水平上均显著抑制TMPRSS2的表达。此外，分子对接和计算分析预测，这些化合物中的大多数还可能抑制SARS-CoV-2的MPRO。

为了探索九种睡茄内酯类在当前新冠肺炎大流行中的治疗潜力，作者将促进病毒进入细胞的宿主细胞表面蛋白TMPRSS2作为靶点。通过分子对接和计算分析以及mRNA和蛋白在对照细胞和内酯处理细胞中的表达，检测了它们与细胞的相互作用，以及减少TMPRSS2表达的能力。在对照细胞和睡茄内酯处理的细胞中，它们分别具有一定阻断和降低TMPRSS2表达的能力。甲磺酸卡莫司他（Camostatmesylate）是一种已知的TMPRSS2抑制剂，以它为阳性对照，分别对九个睡茄内酯类化合物进行对接，它们都对接在TMPRSS2的同一催化位点。每种氢键相互作用的最佳对接姿势如图1。

图2 最佳对接姿势下TMPRSS2残基与配体的相互作用

结果表明，Withanoside-IV和Withanoside-V比阳性对照优；作者还计算了在整个模拟运行过程中蛋白质-配体复合物之间形成的氢键的数量。如图2A所示，Withanoside-IV形成的氢键数量最多，其次是阳性对照、Withanoside-V、Withanolide-B和MethoxyWithaferin-A。除MethoxyWithaferin-A外，所有配体均在同一结合袋中结合，并在最佳对接状态下与相似残基相互作用。此外还计算了与蛋白质结合的各种其他配体的性质，以分析它们的结合稳定性、致密性和溶剂可及性。极性和非极性相互作用的浓度和数量对药物的特异性和对靶蛋白的亲和力起着至关重要的作用。因此，我们接下来分析了整个模拟过程中残基的数量及其在相互作用中的占有率。主要计算了四种相互作用，即氢键、疏水接触(如π-阳离子和pi-pi接触)和两个相反电荷残基之间的离子相互作用。在TMPRSS2的催化位点上，存在大量的极性和非极性的相互作用，时间比例各不相同。在进一步的分析中，我们发现Withanoside-IV具有最高的一致性相互作用次数(>模拟时间的30%)，比阳性对照更好。只有Withanside-IV、和Withanside-V与催化残基(His296、Asp345和Ser441)在相当长的模拟时间内相互作用(图2B-D)。虽然MethoxyWithaferin-A和Withanolide-B也有许多相互作用，但与TMPRSS2的催化结构域残基没有观察到明显的键(图2E和F)。另一方面，在重要残基中，Withaferin-A和Withanone与Ser441相互作用最显著(图2G和H)。与阳性对照相比，Withanoside-IV是所研究的内酯类化合物中最好的抗TMPRSS2的药物。

图3 TMPRSS2与Camostatmesylate和Ashwagandha的分子动力学(MD)模拟分析

N3，一种人工合成的肽类化合物，已被报道在包括SARS-CoV-2在内的不同冠状病毒变种中靶向主要蛋白酶的底物结合口袋。进一步将睡茄内酯类化合物与SARS-CoV-2主要蛋白酶(MPRO)进行分子对接。为了进一步探索MPRO的关键催化位点残基，这些残基参与了与内酯的显著相互作用(超过模拟时间的30%)，计算了模拟相互作用占有率。研究发现，在MPRO-N3抑制剂复合体中，Asn142、Glu166和Thr190主要参与了显著的相互作用。有趣的是，所有的配体在MPRO的催化位点都有各种极性和非极性的相互作用，但Glu166、Cys145和Gln192被发现是与配体形成显著相互作用并提供稳定性的关键残基(图4B-G)。

图4 不同MPRO配体配合物在整个模拟过程中氢键计数的比较

接下来，进行了基于细胞的TMPRSS2表达筛选，如图5A所示，Withaferin-A、Withanone、Withanoside-IV和Withanoside-V处理的细胞TMPRSS2mRNA水平显著降低。此外，虽然在分子对接分析中，Withanolide-A和12-deoxywithastramonolide没有表现出稳定的相互作用，但导致TMPRSS2mRNA的显著下降，提示为多重抑制机制。基于上述数据，入围了Withaferin-A、Withanone、Withantholide-A、Withanoside-IV和Withanoside-V，并研究了它们对TMPRSS2的mRNA和蛋白的影响。如图5B所示，与T.Tn细胞类似，所有化合物(以其无毒剂量使用，由独立实验确定)均导致HSC3细胞TMPRSS2mRNA显著减少。为了进一步验证上述数据，用Westernblotting检测了对照细胞和处理细胞中TMPRSS2的蛋白水平。Withaferin-A、Withanone、Withanside-IV和Withanside-V可下调TMPRSS2蛋白的表达；Withanone处理的细胞TMPRSS2蛋白下调幅度最大(图5C)。与Westernblotting结果一致，我们通过免疫染色观察到处理细胞中TMPRSS2蛋白的减少(图5D)。

图5 不同木兰素内酯对T.Tn细胞TMPRSS2mRNA水平的影响

然后，测试了不同的内酯在VeroE6细胞中抑制SARS-CoV-2复制的能力。如表5所示，几个含有花内酯的化合物导致病毒包膜(E基因)和核衣壳序列(N基因)的表达下调(通过实时荧光PCR检测)，表明它们具有抑制病毒复制的潜力。最后作者猜想了富含睡茄内酯的混合提取物同样能阻断冠状病毒进入宿主细胞并抑制其复制，结果表明其中大多数睡茄内酯具有阻断TMPRSS2和MPRO活性的潜力。如图5F-H所示，这些提取物在转录(图5F)和翻译(图5G和H)水平上都引起TMPRSS2表达下调，从而表明提取物可能作为纯化合物的有效替代品。

总之，本文通过对9个内酯类化合物的大量计算和实验分析，发现其中大多数化合物都能下调TMPRSS2的表达，而Withanoside-V、Withanone和MethoxyWithaferin-A具有同时抑制TMPRSS2和MMPRSS2活性的作用。此外，一些睡茄内酯类能抑制SARS-CoV-2在细胞培养中的复制。由于纯化合物价格昂贵，难以广泛获得，作者还验证了从南非醉茄中制备了富含睡茄内酯类化合物的提取液也有一定疗效，这可能是治疗新冠肺炎的有用资源。

DOI:10.1016/j.ijbiomac.2021.06.015