利用综合的二维NK-92MI细胞膜色谱/C18柱/飞行时间质谱系统从黄芪中筛选免疫细胞激活物

免疫疗法已成为临床实践中肿瘤治疗的重要策略。自然杀伤（NK）细胞是重要的先天免疫细胞，在现代免疫治疗中具有很大的发展前景。有研究表明，杀伤细胞凝集素样受体K1的表达可以通过黄芪（AR）上调，以改善NK细胞的杀伤作用。细胞膜色谱（CMC）是一种基于膜受体和配体之间选择性相互作用的生物色谱分析方法。使用3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTS）改性的硅胶制备CMC色谱柱，可提高CMC色谱柱的寿命和稳定性。

此项研究中，为了鉴定可以改善NK细胞功能和活性的化合物，研究者建立了一个全面的2D NK-92MI / CMC系统，以筛选AR对的NK-92MI细胞膜受体具有亲和力的组分。NK-92MI柱/C18色谱柱/TOFMS系统主要由安捷伦1，200系列HPLC系统和安捷伦6，220 TOF质谱仪组成。

采用全面的二维NK-92MI/CMC系统筛选AR萃取中的潜在活性物质。AR化合物鉴定结果见表1，7种化合物保留在NK-92MI/CMC柱上。异黄芪甲苷I和黄芪甲苷IV两种高丰度化合物在NK-92MI/CMC色谱柱上均有显著保留，接下来对这两者对NK细胞杀伤活性的影响进行了深入研究，选择流式细胞术和LDH测定作为主要方法。在异黄芪甲苷I的浓度高达10μM时，NK-92MI细胞的细胞毒性以剂量依赖性方式显着增加。当黄芪甲苷IV浓度高达0.5μM时，样品组和对照组之间存在显着差异。为了消除药物对K562细胞的抑制作用，在不添加NK-92MI细胞的情况下进行了相同的实验，这两种药物在相应的浓度范围内对K562细胞几乎没有影响。结果表明，二者可以在一定浓度范围内促进NK-92MI细胞的细胞毒性。LDH是存在于活K562细胞细胞质中的一种酶，它不能穿透细胞膜。当K562细胞被NK-92MI细胞的细胞毒性破坏时，细胞膜的通透性发生变化，LDH可以在细胞外释放。所以基于LDH测定的进一步研究揭示了类似的结果。

本研究首次成功将MPTS修饰的固定相化学修饰策略应用于NK-92MI细胞膜蛋白亲和组分的筛选。与传统CMSP相比，使用MPTS改性硅胶可以通过与氨基反应，与更多的细胞膜结合，获得更高的色谱柱效率。但使用提取的细胞膜作为固定相材料，不可能筛选特定膜受体的活性成分，筛选系统的特异性受到限制。

图1 实验的总体流程图

图2 综合二维自然杀伤剂（NK）-92MI/细胞膜色谱（CMC）/CMC柱/C18柱/飞行时间质谱（TOFMS）系统的简要方案：(A)位置1和(B)位置2

图3 (A)采用综合二维自然杀伤剂（NK）-92MI/细胞膜色谱（CMC）柱和(B)对照/CMC柱获得的异氟杂交线和亚硒混合标准品的典型二维（2D）图

图4 (A)黄芪提取物的综合二维（2D）图谱;(B)通过综合二维自然杀伤剂（NK）-92MI/细胞膜色谱（CMC）柱/C18柱/飞行时间质谱系统获得的标准溶液的二维图

表1 二维自然杀伤-92mi/细胞膜层析分析系统中的9种潜在活性成分

图5 （A）流式细胞术分析不同浓度的异黄芪甲苷I对自然杀伤剂（NK）-92MI细胞的细胞毒性的影响(B)流式细胞术：异黄芪甲苷I对NK-92MI细胞诱导的对K562细胞的细胞毒性的影响(C)异黄芪甲苷I对K562细胞凋亡的影响(D)乳酸脱氢酶（LDH）检测：异黄芪甲苷I对NK-92MI细胞诱导的对K562细胞的细胞毒性的影响

图6分析不同浓度的黄芪甲苷IV的影响（分析方法同图5）

DOI: 10.1016/j.jpha.2022.05.006