芦荟-大黄素衍生物作为 Akt、NF-κB和JNK 信号通路潜在调节剂的设计、合成与抗炎评价

炎症是对血管系统活组织中损伤因素的一种防御反应。它的发生可能有多种原因，如病原体、组织损伤和暴露于刺激物。非甾体抗炎药(NSAIDs)是最常用的炎症治疗药物之一。然而，它们的使用受到胃肠道、心血管和肾毒性问题的阻碍。因此，安全有效的抗炎药物的研究与开发是十分必要且紧迫的。

蒽醌类药物是一系列广泛分布在许多传统中草药中，并与多种生物和药物活性有关的天然存在的化合物。芦荟大黄素(AE)便是其中一种具有代表性的蒽醌类化合物，其主要从芦荟叶和大黄的根/根茎中分离出来（图1）。迄今为止，AE已被证明具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗纤维化和抗炎作用。机制研究表明，AE可以抑制iNOS、IL-6和IL-1β基因，并可以抑制LPS诱导的iNOS蛋白表达、IκBα降解以及ERK、p38、JNK和Akt的磷酸化。

在母体先导化合物中引入含氮取代基是药物设计中一种普遍的修饰策略（图2）。含氮取代基，特别是含氮杂环取代基是药理活性化合物的关键组成部分，可作为新的氢键供体和受体，增加与酶的结合亲和力，提高其理化性质。因此，在该研究中，作者将该策略应用于芦荟大黄素的结构修饰，并设计并合成了一系列含氮的芦荟大黄素衍生物。由于芦荟大黄素的溶解度较差，因此引入了一些水溶性含氮杂环，如吗啉和哌嗪，在增加活性的同时增加了溶解度。评价了合成衍生物的抗炎活性，并选择了最有前途的分子进行进一步的药理机制研究。

化学合成部分。（此处省略细节描述）作者设计了如下表所示的三个系列的化合物，以备后续活性研究。

脂多糖诱导NO产生的抑制作用及构效关系分析。该研究以地塞米松为阳性对照，评价所有合成的衍生物对小鼠诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞NO产生的抑制作用。筛选结果汇总如图3所示。大多数衍生物在浓度为10μM时对NO的产生有明显的抑制作用，比阳性对照药物地塞米松更有效。在浓度为5μM时，除3i外，其他衍生物表现出与地塞米松相当或更好的抑制作用。其中，2i在浓度为5μM时表现出最强的抑制活性，比原化合物AE和阳性对照药物地塞米松更有效。作者进一步研究了不同浓度的2i对NO的抑制能力。结果表明，2i能显著降低NO(半抑制浓度=3.15μM)的产量，并呈浓度依赖性(图4a)。初步的构效关系(SAR)研究表明，含有链脂肪族氨基的化合物具有与含有杂环氨基的化合物相似的抑制作用，其中N-甲基哌嗪(2i)是其活性的最佳取代基。

细胞毒性评价。采用MTT法测定了RAW264.7细胞中最有效的化合物2i的细胞毒性，以消除其可能产生的细胞毒性对细胞产生NO的检测的影响。如图4b所示，在浓度高达25μM时，2i没有明显的细胞毒性，说明2i的抗炎活性不是由于其细胞毒性。因此，作者选择了2i来进行进一步的评价。

一氧化氮自由基清除能力的评价。为了研究2i是否能直接清除一氧化氮自由基，作者采用了一个非细胞系统，以硝普钠(SNP)作为一氧化氮供体。结果显示，在SNP溶液中，不同浓度的2i对一氧化氮自由基没有显著的降低(图4c)。这一结果表明，2i不能直接清除一氧化氮自由基，而2i对NO产生的抑制作用并不是由清除一氧化氮自由基引起的。

抑制促炎细胞因子的产生能力的评价。为了进一步评估2i对炎症细胞因子的抑制作用，作者评估了其对TNF-α、IL-1β、IL-6和pge2的抑制作用。用不同浓度的2i(3.125、6.25和12.5µM)处理LPS刺激的RAW264.7细胞24h，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的水平。如图5所示，经LPS诱导后，TNF-α、IL-1β、IL-6、pge2水平明显升高。由此可以提示2i显著抑制了LPS诱导的上述炎症细胞因子的分泌，且呈浓度依赖性。

抑制IL-1β、IL-6和COX-2mRNA表达的作用评价。作者采用实时荧光定量PCR方法检测了LPS刺激的RAW264.7细胞中IL-1β、IL-6和COX-2mRNA的表达。LPS上调IL-1β、IL-6和COX-2mRNA的表达，而2i显著抑制上述三种细胞因子的mRNA表达水平，且呈浓度依赖性（图6）

对脂多糖诱导的NF-κB通路激活的抑制作用评价。作者通过免疫印迹法检测了2i对细胞质和细胞核中IκBα和p65蛋白表达水平的影响。此外，作者还通过免疫荧光法分析了2i对p65从细胞质转移到细胞核的影响。如图8所示，在LPS处理的RAW264.7细胞中，经2i处理后，IκBα的表达显著上调。对2i对p65表达的影响的研究显示，在LPS诱导的RAW264.7细胞中，2i对细胞质中p65的总蛋白水平没有影响(图8b)，但细胞核中p65的水平显著降低了2i(图8c)。免疫荧光分析进一步表明，LPS诱导后，细胞核中p65水平显著升高，但2i有效抑制了p65向细胞核的易位。以上结果表明，2i可以阻断脂多糖诱导的IκBα降解，并抑制参与脂多糖诱导的炎症反应的NF-κB通路的激活。

对LPS诱导的Akt通路激活的抑制作用评估。蛋白激酶B(Akt/PKB)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是NF-κB激活的主要上游信号分子。它通过PI3K/Akt通路的磷酸化而被激活。激活的Akt可以通过激活IκB激酶降解IκB，然后引起NF-κB的核易位。为了确定2i是否影响LPS诱导的Akt信号通路的激活，作者研究了2i对Akt磷酸化的影响。如图9a所示，LPS刺激显著提高了Akt的磷酸化水平。而2i显著抑制了Akt的磷酸化或称。这一结果表明，2i可能通过抑制Akt通路来抑制NF-κB的转录活性。

对脂多糖诱导的MAPK通路激活的抑制作用。除了NF-κB，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，包括ERK、p38和JNK，也在炎症的调节中发挥重要作用。研究表明，MAPK可以通过激活一系列磷酸化级联反应来调节炎症介质的合成。因此，作者通过免疫印迹法检测2i对LPS诱导的MAPK信号通路的影响。结果显示，与对照组相比，LPS显著提高了p-ERK、p-p38和p-JNK蛋白的表达水平。2i仅以浓度依赖的方式阻断LPS诱导的JNK磷酸化，而对ERK或p38的磷酸化没有影响(图9b-d)。

综上所述，作者合成了20种含氮芦荟大黄素衍生物，并检测了它们对RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用。初步结果表明，大部分化合物表现出良好的NO抑制活性和低毒性。构效关系研究表明，N-甲基哌嗪是其活性的最佳取代基。进一步研究NO抑制活性最好的2i的抗炎作用，发现其显著降低了TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的水平，下调了iNOS和COX-2的表达水平。初步机制表明，2i通过抑制Akt、NF-κB和JNK信号通路，抑制LPS诱导的iNOS和COX-2的表达和炎症因子的产生。以上结果表明，这些衍生物可能是Akt、NF-κB和JNK信号通路的潜在调节因子，从而具有抗炎作用。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2022.114511