双孢蘑菇多糖的提取、纯化、理化性质及生物活性研究进展

概 述

OVERVIEW

前 言TNTRODUCTION

双孢蘑菇是营养丰富的食用菌，具有药用价值和生物活性。在传统医学和营养药物中用于治疗各种人类和动物疾病。有许多蘑菇物种表现出多样的生物活性，具有很大的研究价值。迄今为止，已有许多关于蘑菇多糖的生物活性及其作用机制的研究。双孢蘑菇是伞菌目和口蘑科的一种担子菌类真菌，通常被称为白按钮蘑菇(图1)，并且是经济上重要的商业作物。自20世纪90年代末以来，它变得越来越重要，在欧洲和北美广泛种植。目前，双孢蘑菇在全球食品市场上很受欢迎，因为它的营养价值和含量丰富的麦角硫因，硒和多糖。

多糖由一类碳水化合物组成，也称为聚糖，是具有10个以上相连单糖单元的复杂大分子化合物。自然界的糖类基本上以多糖的形式存在，具有多种生物活性，包括抗炎、抗糖尿病、抗辐射、抗氧化、抗结核、抗肿瘤等作用。此外，多糖具有作为天然、绿色、非特异性免疫促进剂的特殊功能，广泛存在于动物和植物中。近年来，学者们不仅对双孢蘑菇多糖的提取和分离进行了广泛的研究，还对其化学结构和生物活性进行了研究。本综述全面总结了多糖的提取方法、化学结构和生物活性，讨论了抗体的结构特征与生物活性的关系，有助于提高双孢蘑菇多糖的价值和利用率。

方 法METHOD

分离和纯化方法

ABPs是多功能的，根据分布可分为胞内多糖(IPS)和胞外多糖(EPS)两大类。双孢蘑菇多糖通常用热水、酸性或稀碱溶液提取。热水提取是最方便的方法，在实验室和工业中广泛使用。通过热水，细胞的血浆壁被分离，液泡的内容物通过扩散到外部溶剂中而溶解。但热水提取法存在提取时间长、温度高、多糖降解等缺点，影响提取效率。因此，有必要优化热水提取多糖的方法。除了超声波处理和微波辐射，酶水解也用于加速细胞壁多糖的溶解，以提高多糖提取效率，减少提取时间和溶剂消耗。碱溶液提取的ABPs收率为4.31±0.25%。在温和的条件下，酶可以破坏细胞壁和细胞膜的结构，这有利于细胞中多糖和营养物质的释放和溶解。样品用复合酶提取(木瓜蛋白酶∶果胶酶∶纤维素酶的比例为1∶1∶1，提取量为1.0-2.6%)，ABPs粗品的得率可达6.87%。超声空化效应可以加速多糖释放到溶剂中的量。采用超声波辅助提取法，双孢蘑菇子实体和菌丝体的总蛋白得率分别为6.02%和3.43%，远高于单纯水提取法。真菌细胞壁的示意性结构和不同提取方法的机理如图2所示。总的来说，提取抗体的方法仅限于传统的酸，碱，热水，超声波和酶辅助提取(EAE)方法。我们的研究小组使用超声波强化亚临界水提取法(USWE)从香菇中提取多糖。香菇多糖的最高提取率为17.34%。清除USWE样本所需的2，2-二苯基-1-苦基-酰肼(DPPH)的半最大抑制浓度值为0.232毫克/毫升。与亚临界水萃取(SWE)、阿联酋和热水萃取(HWE)样品相比，USWE样品具有更好的DPPH还原能力。这些提取方法的机理、优点和缺点如表1所示。目前关于双孢蘑菇多糖提取率的信息很少。从子实体中提取的多糖的产量高于从菌丝体中提取的多糖。这些结果表明，影响双孢蘑菇多糖提取的因素很多，提取率可能因提取方法、参数、原料来源和真菌部位的不同而有很大差异。因此，选择合适的原料或部位，优化提取方法，可能是提高多糖提取率的有效途径。例如，阿联酋可以通过使用不同的超声波探头，功率水平，超声时间间隔和时间进行优化。EAE可以针对单一酶、复合酶或酶比例进行优化。随后研究了双孢蘑菇的提取试验亚临界水提取法、超高压提取法、超声波强化亚临界水提取法和超声波提取结合酶提取法。此外，通过离心和乙醇沉淀直接从发酵液中获得胞外多糖。为了获得最佳提取结果，许多研究使用Box-Behnken设计来确定单因素实验，以优化水温、提取时间、料液比和提取次数，以及每个变量的最佳。最后，离心后收集粗胞外多糖。随后，具有较浅颜色和较少杂质的粗多糖通过使用Sevag方法用氯仿和1-丁醇(4∶1)的混合物除去蛋白质层和色素进一步纯化，随后透析和冷冻干燥。一种常用的纯化技术是凝胶过滤柱色谱法，用于分离不同分子量的多糖。另外，离子交换色谱能够通过梯度盐洗脱分离中性多糖。ABPs的纯化可以通过离子交换色谱(琼脂糖凝胶CL-6B柱)和超滤离心进行，然后通过高效凝胶渗透色谱来鉴定ABPs的分子量。此后，用合适的流动缓冲液洗脱多糖级分，浓缩，透析和冻干以获得纯多糖。图3总结了从双孢蘑菇中提取和纯化多糖的步骤。

图2 .真菌细胞壁结构示意图及多糖不同提取方法的机理

图3 .双孢蘑菇多糖提取和纯化的示意图

大多数单糖组分被酸水解，然后衍生化，通过气相色谱和高效液相色谱进行单糖组成分析。传统的检测方法需要单糖的衍生化，实验繁琐。因此，以前的研究提出了更快的单糖组分分析方法，如高效阴离子交换色谱和脉冲安培检测。这些方法更快，因为它们不需要衍生。多糖受多种因素影响，如原料来源和纯化方法。而ABPs主要由不同摩尔比的Glc和甘露糖(Man)和Gal组成。例如，EnAPS-1、-2和-3的单糖组分是纯化分离双孢蘑菇粗多糖后得到。EnAPS-1和-2单糖都含有Man、Gal和Glu、Rha、Fuc和Xyl，而EnAPS-3单糖由Man、Gal、Glu和Xyl组成。人:Gal: Glc: Xyl的组成比为28.26:27.82:20.88:9.87，主要通过β键连接。通过二乙氨基乙基纤维素52色谱和葡聚糖凝胶G-100色谱纯化粗制ABP，并产生一个级分ABP-1。通过高效液相色谱法评估主峰的单糖组成，发现其主要由葡萄糖(97.6%)和少量半乳糖(2.4 %)组成。研究人员开发了一种加压水提取(PWE)方法，其中从双孢蘑菇提取物中分离的粗多糖(PSC)部分主要包含β-葡聚糖(包括壳聚糖)、α-葡聚糖和其他PSC(杂蛋白/葡聚糖)。研究了FPS、IPS和EPS多糖的单糖组成。结果表明，FPS、IPS和EPS的多糖结构不同，FPS组分主要由人组成，IPS主要由灵芝多糖组成，EPS主要由半乳糖组成。

用于测定平均分子量和多分散性指数的典型方法，在许多抗体研究中使用，基于相同的方法，主要是高效液相色谱法、凝胶渗透色谱法(GPC)、高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)和GPC与高效液相色谱法的结合。在不同的实验条件下，观察到分子量范围为20–160千道尔顿的双孢蘑菇。双孢蘑菇水溶性粗多糖的分子量用凝胶渗透色谱法测定。主、次分子量分布分别为5.09×104和2.17×104道尔顿。

虽然有许多关于ABPs的单糖组成和分子量的研究，但很少发表结构信息。从双孢蘑菇中提取的一些多糖的基本结构特征如下。甲基化分析和α-淀粉酶降解的结果表明，双孢蘑菇多糖中存在一种α-葡聚糖，其主链由(1→4)个以α-D-葡聚糖形式连接的单元组成。一个单位的吡喃葡萄糖被1:8取代。用气相色谱质谱联用仪分析了一些甲基化糖醇乙酸酯。发现多糖的主链由α-(1→4)-Glcp残基组成。Me3-Glcp (72.5 %)衍生物和2，3-Me2Glcp (8.3 %)残基的存在表明该分子在O-6位分支。非还原端基组成为2，3，4，6-Me4-Glcp (9.9%)。这些分支由Glcp和Galp残基组成，表明存在Gal葡聚糖而不是葡聚糖。78.9处的符号表示Glcp单元的O-4取代的衍生物，这表明大多数单糖是(1→4)连接的。双孢蘑菇的分离多糖是一种α-葡聚糖，其主链由(1→4)个相连的单元组成，在O-6处有一个α-Dglucpyranose取代的单元。该抗体的红外光谱显示，该抗体有一个典型的多糖吸收峰和一个吡喃环。核磁共振谱结果表明，在1H核磁共振谱中β-异头体的信号出现在小于5ppm的范围内。结合红外数据和核磁共振光谱信号的结果，确定该抗体由β-糖基糖苷键组成。ABPs的主要成分是Rha，但在FPS部分没有发现。此外，在西藏双孢蘑菇的提取物中，FPS的多糖结构不同于其他地区。研究人员还发现，氧化铈连接只存在于FPS部分，与双孢蘑菇的其他区域一样，FPS多糖含有1，3-连接的半乳糖和1，3，6-连接的人糖苷键。在双孢蘑菇中，90%的多糖部分由α-葡聚糖组成。分析纯化的FPS的片层壁片段。细胞壁的分级根据多糖的溶解度和营养细胞的甲基化分析，从子实体(茎和堆)壁获得的级分具有较大的化学结构差异。

生物活性

通过大量药理活性和动物实验的评估，表明ABP具有促进健康的生物活性，如免疫、抗氧化、抗肿瘤和保肝作用。而且药效显著，不良反应少，因此多糖被不断开发和利用。在理论的基础上，详细总结和讨论了抗体的各种生物活性和健康益处。先前的研究表明，细胞因子刺激的信号转导途径参与了许多重要的生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节。多糖的主要生物途径是线粒体膜去极化、一氧化氮(NO)、核因子κB信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。其他研究表明，多糖很少直接作用于癌细胞；它们通过激活吞噬细胞或直接攻击病原体的自然杀伤细胞来增强人体免疫力。如图4所示，受刺激的巨噬细胞产生细胞因子(干扰素、白细胞介素等)。)，设计破坏癌细胞的因素。辅助性T细胞通过促进体液和细胞免疫功能并激活效应性T细胞来杀死感染或异常细胞，从而识别和破坏异常细胞。此外，线粒体在凋亡中也起着关键作用，caspase是凋亡的主要成分。半胱天冬酶在细胞死亡过程中根据其功能分为起始物和效应器。起始物是半胱天冬酶-2、-8、-9和-10，效应器是半胱天冬酶-3、-6和-7。在线粒体凋亡途径中，凋亡分子细胞色素C (cytC)从线粒体内膜空间释放到细胞质中。CytC直接激活凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apaf- 1)和caspase-9，后者激活下游效应酶caspase-3，导致凋亡。此外，大多数多糖通过“核糖体应激反应”机制增强免疫力，并快速激活MAPK，MAPK在其C末端附近的丝氨酸处被磷酸化。这种丝氨酸磷酸化显著增强了信号转导子和转录激活子的激活。

氧化会导致多种疾病，包括糖尿病、阿尔茨海默病和心脏病。目前，除了丁基化羟基茴香醚(BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT)之外，还有许多合成抗氧化剂，如D，L-α-生育酚乙酸酯。有些有潜在的副作用，但有些没有。此外，大多数动物研究表明，合成抗氧化剂与天然抗氧化剂(如维生素C)的相对生物利用度存在差异。食品多糖和食品同源提取物的抗氧化活性引起了研究者的关注。最近，研究表明，通过将抗体浓度增加到250μg/mL，DPPH清除效果得到改善。与BHT(83%)相比，ABPs具有更高的自由基清除活性(86.1%)，并且清除羟基自由基的能力随浓度的增加而增加。在不同浓度下，花生四烯酸多糖的抗氧化活性高于维生素C。当其浓度低于80μg/mL时，ABPs的自由基清除活性显著高于Vc，且基础活性呈浓度依赖性。研究表明，碱提取多糖及其组分的体外抗氧化活性在0-1.0毫克/毫升的范围内是稳定的。此外，亚铁离子、羟基自由基和DPPH自由基的螯合活性使A1APS具有明显的清除作用，这取决于纯化组分的水平。低分子量的AlAPS，如AlAPS-2，具有很高的抗氧化活性。研究了ABPs组分ABP-1的抗氧化活性其清除2，2-二苯基-1-吡啶基和羟基的能力。其还原铁的能力也通过铁还原抗氧化性能(FRAP)测定来测定。在浓度为1.2毫克/毫升时，ABP1似乎具有有效的自由基清除活性，清除率约为56% 。这些结果表明，ABPs是一种很有前途的抗氧化剂。研究重点应放在物质基础、抗氧化机制以及不同多糖成分活性差异的原因上，可以使用不同的方法和机制来评估ABPs的抗氧化活性，例如总氧化剂清除能力(TOSC)、布里格斯-劳舍尔振荡反应的抑制、化学发光、荧光分析、薄层色谱生物自动成像和细胞抗氧化活性(CAA)分析。除了确定各种成分抗氧化活性的整个过程的复杂性之外，必须记住体外测定只能对其特定反应系统的抗氧化活性进行排序，并且它们与体内保护功能的相关性是不确定的。因此，谨慎的做法是使用一种以上类型的抗氧化剂测定来测量抗氧化剂活性，并且至少包括一种具有生物学相关性的测定。

图4 .多糖生物活性的信号通路

真菌多糖对免疫系统的调节尤为重要，不仅可以保护免疫相关器官，还可以增强巨噬细胞、淋巴细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞的功能。免疫细胞活性，如LAK细胞的活性，可以促进抗体产生和细胞因子分泌，并激活补体系统，以增强身体的免疫系统功能。最近的另一项研究表明，ABPs还能增强T淋巴细胞转化能力，激活巨噬细胞吞噬活性，促进血清溶血素的分泌以调节免疫。巨噬细胞通过产生细胞因子、向T细胞呈递抗原和直接吞噬病原体在宿主防御中发挥重要作用。多糖通过产生促炎分子(如细胞因子和一氧化氮)来调节巨噬细胞的功能，并通过增强宿主免疫来实现关键的抗肿瘤作用[144]。在用ABP-1和ABP-2处理J774A.1巨噬细胞时，IL-6和TNF-α的水平显著高于脂多糖(LPS)诱导的水平(p

许多研究表明，ABPs具有良好的抗肿瘤作用和多种抗肿瘤机制。它们的抗肿瘤活性受许多因素影响，如分子大小、形态、支化程度和在水中的溶解度。多糖的分子量越高，水溶性越高，抗肿瘤活性越强。通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)释放试验在400μg/mL下评估HepG2细胞的生存力，RK2-Ab在HepG2细胞中诱导细胞毒性，并且在600和800μg/mL下显示相似的毒性。RK2-Ab以400μg/mL的浓度也促进了cytC的双倍释放。然而，在更高的浓度(600微克/毫升)下，cytC的释放没有增加。RK2-Ab处理的HepG2和ASA细胞显示ATP含量减少66%。用膜联蛋白V-FITC和聚酰亚胺对肝癌细胞进行双重染色，并用流式细胞术进行评估。结果与MTT法和乳酸脱氢酶法的结果相似。双孢蘑菇β-D-葡聚糖在肝细胞中没有诱导明显的细胞毒性，仅在相同条件下对HepG2细胞具有细胞毒性，表明细胞是选择性的。从FPS、IPS和EPS级分中提取导致胸腺和脾脏指数显著增加。血清细胞因子分泌的白细胞介素-2和白细胞介素-4、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的增加降低了正常小鼠CD3+ CD8+淋巴细胞的水平。在用环磷酰胺、FPS、IPS和EPS处理的小鼠中，观察到胸腺和脾脏指数显著恢复，同时淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞的吞噬活性以及白介素-2、白介素-6、白介素-10、白介素-17、肿瘤坏死因子-α和免疫球蛋白G水平增加。

临床上，血清标志物如丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)水平用于评估肝保护潜力。肝脏抗氧化参数超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)显著拮抗四氯化碳的前氧化。这些发现表明双孢蘑菇AlAPS组分有效地降低了谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶的活性和白蛋白水平。此外，还研究了FPS对四氯化碳所致小鼠肝损伤的保护作用。高FPS剂量治疗组肝细胞损伤明显减轻。模型组TGF-β1和Smad3表达水平显著升高(p

结 果RESULT

双孢蘑菇是一种有营养和医学价值的同源真菌。它不仅是一道美味的菜肴，而且对提高人们的生活质量和身体机能也有药用价值。多糖被认为是双孢蘑菇中最重要的成分，具有广泛的生物活性，包括免疫、抗氧化、抗肿瘤和抗炎功能。目前，双孢蘑菇多糖的复合EAE产量最高。由于来源和提取方法的影响，提取的多糖种类繁多，分子量不同。结果表明，高分子量的抗体在刺激巨噬细胞方面更为活跃，并可能增强抗氧化能力。此外，特定单糖对生物活性有显著影响，如葡聚糖具有线性(1→6) β-Dglucan等免疫调节活性，Rha单糖可能在维持抗衰老作用中起重要作用，Fuc单糖对抗损伤感觉有保护作用。至于杂多糖，发现显示抗氧化，抗炎和抗肿瘤活性。此外，高分子量的杂多糖可能在抗癌作用中更活跃。此外，相对较低的分子量可以提高杂多糖的抗氧化性。然而，目前对ABPs结构性能的研究在许多方面仍需进一步研究。首先，ABPs的提取方法很少，主要采用热水提取方法。第二，体内和体外实验对动物的影响可能不适用于人类。第三，ABPs的生理活性可能受到其他次要成分的影响，如多酚和蛋白质。因此，对于ABPs的提取方法，研究人员可以尝试使用绿色、高效、低消耗的提取技术，如SWE、UAE、MAE和UHPE或多种技术组合。此外，为了确定抗体对健康的影响，必须进行人体临床研究。此外，由于多糖分子的结构多样性，包括它们的构象和复杂链的结构多样性，这些多糖的高阶结构仍然不清楚，并且它们的结构和生物活性之间的关系还没有很好地建立。因此，有必要进一步研究双孢蘑菇的确切结构和生物活性。此外，在目前的研究中，从双孢蘑菇中提取多糖的原料、提取方法以及分离纯化方法存在很大差异。这些多糖的结构和生物活性也有很大差异，很难保证研究结果的一致性、重复性和可靠性。因此，有必要建立一种标准的多糖收集和制备方法，可作为确定化学结构、链构象和生物活性的参考，并可用于食品、药物和化妆品。关于多糖的研究方向，结合其他成分(蛋白质、多酚和硒)的分析已成为研究的重点。虽然多糖聚合物表现出明确的结构性质和生物活性，但这些化合物的生物活性机制尚不清楚，可能是未来研究的重点。此外，多糖的生物活性与其理化性质密切相关，缺乏对不同地区多糖提取物的可靠评估。同样，生物活性和化学结构之间的关系也没有很好地建立起来。在表征多糖结构时，快速、可以进一步优化组成单糖的破坏性和低消耗检测方法。此外，为了更好地预测单糖组分，建立一个稳健的数学模型应该是未来研究的主要重点。