黑姜中的槲皮素3，5，7，3‘，4’-五甲基醚直接且有效激活人源Sirtuin 1

近年来关于直接激活sirtuin 1靶点是否可以起到延年益寿的正面效果，以及sirt 1激活剂（STACs）是否在体内直接激活sirt 1而改变遗传表观性状一直备受争议。其中争议最大的是白藜芦醇（RV）。因为体外筛选STACs的方法是利用人工合成的荧光修饰的短肽（Ac-p53-AMC），有研究表明RV可以增强sirt 1与Ac-p53-AMC的结合，从而降低其米氏常数（Km），而对sirt 1在体内的天然底物Ac-p53无此效应。但是science 2013年证明了白藜芦醇激活sirt 1降低其与FOXO3a的Km从而发挥作用，并证明了STACs同时结合sirt 1 N端与底物进一步稳定sirt 1构象。

2021年日本东京大学的Koji Nagata团队在《communications biology》上发表的“Quercetin 3,5,7,3′,4′-pentamethyl ether from Kaempferia parviflora directly and effectively activates human sirt 1”再一次直接证明了天然STACs槲皮素3,5,7,3',4'-五甲基醚（KPFM-8）直接激活sirt 1。

首先作者利用Ac-p53-AMC对KPFM-8的体外sirt 1的激活作用进行了验证，结果表明KPFM-8在2 μM时激活sirt 1活性25倍，而RV达到相同激活效果时浓度为100 μM。之前研究表明sirt 1激活作用中关键区域为N端区域（NTD，氨基酸序列：183-230），其中最关键的氨基酸残基为Glu230。因此，还研究了KPMF-8是否作用于sirt 1中NTD和Glu230。作者重组表达了不含NTD的SIRT 1蛋白(243-510，不含NTD和C端CTD，图1a)和SIRT 1-E230a突变蛋白。SIRT 1(243-510)和SIRT 1-E230a突变体仍然保留了76和95%的催化活性(补充图1b)。在截断NTD的sirt 1(243-510)结构中，KPMF-8或RV对sirt 1的激活被完全取消，而在sirt 1-E230a突变体中则显著减弱(补充图1c, d)。表明KPMF-8和RV作用于NTD端的Glu230起到激活作用。由于上述sirt 1活性试验中使用的底物是荧光标记的，因此对KPMF-8分子是否是sirt 1的直接激活剂，是否能够增加sirt 1对相应的非标记肽的活性。作者使用非标记的Ac-p53肽进行了HPLC-质谱分析(HPLC-MS)。结果表明KPMF-8依然对sirt 1具有激活作用。

随后作者通过等温量热滴定法测定了KPMF-8和RV与sirt 1(243-510)是否结合，结果表明两个化合物与sirt 1基本不结合。而KPMF-8和RV与sirt 1（183-510+GS+641-665）再次证明NTD是KPMF-8激活sirt 1的主要位点（图2）。此外，作者采用天然底物Ac-p53考察了KPMF-8是否为底物依赖性激活sirt 1。当Ac-p53存在时，KPMF-8与sirt 1的结合更为紧密，这些数据表明（图3），sirt 1与底物结合的过程可能会引起构象变化，使变构结合位点暴露给激活剂，激活剂调控sirt 1的机制依赖于底物。

为了阐明KPMF-8或RV激活sirt 1的潜在机制，是通过增强sirt 1与底物的亲和力还是进一步稳定sirt 1蛋白构象，作者分析了添加或不添加KPMF-8、添加或不添加RV时sirt 1 (183-510 +GS+ 641-665)与Ac-p53肽的结合亲和力。如图4所示，ITC测量显示sirt 1 (183-510 +GS+ 641-665)与Ac-p53肽之间的解离常数(KD)为55.0 μM。当加入0.2 mM RV时KD = 38.8 μM，约为不加药物时的1.4倍。而0.2 mM的KPMF-8的KD = 6.67 μM，约8倍。这些结果表明，RV和KPMF-8增强了sirt 1 与天然底物肽Ac-p53的结合，且KPMF-8比RV效果更好。

作者通过分子对接及1H–15N HSQC谱图测定了KPMF-7与sirt 1 NTD上的作用位点（图5），发现与KPMF-8结合主要导致了helix2 (α2)和helix3 (α3)上氨基酸残基的化学位移变化。属于螺旋1 (α1)上的两个残基Y185和V188，以及位于α2和α3连接处的氨基酸残基T209和I210的共振也受到了扰动。将KPMF-8添加到sirt 1 NTD中，导致四个侧链NH2共振对中的两个发生显著的化学位移变化(图5a)。在sirt 1 NTD结构上绘制这些位移残基，可以发现sirt 1 NTD与KPMF-8和白藜芦醇结合产生明显化学位移干扰的区域是部分一致的，主要位于helix2–turn-helix3 (α2-T-α3)区域(图5c, f)。

作者使用Autodock Vina进行对接模拟，构建sirt 1 NTD与KPMF-8和白藜芦醇的结合模型。基于NMR结果和对接结果，作者使用sirt 1 NTD与KPMF-8的binding mode(图6a)，该模型显示了溶液状态下最可能的KPMF-8-sirt 1 NTD复合结构。用同样的方法构建了sirt 1 NTD和白藜芦醇的对接结合模型(图6b)。对接模型与resveratrol-sirt1-Ac-p53-AMC晶体结构的比对显示，白藜芦醇在晶体中的对接位置与Res1（三个RV分子中直接与蛋白作用的一个）几乎相同(图6c)。

作者通过分子动力学分析（MD）再次证明，与核磁共振数据一致，位于sirt 1 NTD-KPMF-8复合物的α1基序的残基显示出相对于sirt 1 NTD-RV复合物的残基有更高的接触概率，这表明KPMF-8和sirt 1 NTD之间的相互作用表面比RV和sirt 1 NTD之间的表面更宽（图7）。

在确切验证了KPMF-8与sirt 1 NTD部分的结合位点后，作者通过荧光共振能量转移(FRET)技术考察了KPMF-8是否会引起全长的sirt 1构象变化，实验结果表明在底物Ac-p53存在时KPMF-8引起了sirt 1的构象变化（图8）。

最后，作者在MCF-7细胞上验证了KPMF-8对去乙酰化作用的增强及靶点特异性(图9)。

该篇文章从已报到天然sirt 1激活剂出发，全面验证了该分子如何与该蛋白结合从而发挥激活效应。大致示意图如下。