三七皂甙R1通过AMPK/Drp1介导的线粒体分裂减轻过敏性鼻炎

过敏性鼻炎（AR）是由免疫球蛋白E（IgE）介导的鼻粘膜I型超敏反应，以Th2免疫反应为特征。它表现为鼻粘膜的慢性炎症，影响全球约10-40%的人口。线粒体通过不断分裂和融合来维持其内环境平衡，在过敏性疾病中起着重要作用。据报道，在PM2.5诱导的肺损伤中，线粒体1(Fis1) 和动力相关蛋白 (Drp10) 的表达以及活性氧（ROS）的产生显著上调。在过敏原诱导的哮喘中，炎症导致线粒体Drp1上调和MFN2下调，从而触发内质网应激，导致氧化损伤，并加剧哮喘。在本研究中，作者发现三七皂苷PNS-R1在AR过敏性炎症中的抑制作用，结果表明，PNS-R1通过减少线粒体分裂和凋亡显著改善AR症状。

图一：PNS-R1对AR小鼠炎性细胞浸润、IgE、促炎细胞因子表达和Th1/Th2失衡的影响。

首先为了测试PNS-R1对AR的治疗效果，作者记录了打喷嚏和擦鼻的次数。结果表明，PNS-R1治疗显著减少了AR小鼠的喷嚏次数和鼻摩擦次数。HE染色显示PNS-R1减少了鼻粘膜下层的浸润性嗜酸性粒细胞和炎症。ELISA结果显示，小鼠血清和鼻腔灌洗液（NLF）中OVA特异性的IgE的浓度显著低于模型组。同时，PNS-R1还降低了炎症因子的水平。此外，PNS-R1治疗后，AR小鼠淋巴结和脾脏中IL-4+CD4+CD3e+的比例降低，而IFN-γ+CD4+CD3e+的比例增加。这些结果表明，PNS-R1治疗显著减轻了AR小鼠的炎症反应，并恢复了Th1/Th2失衡。

为了验证PNS-R1对AR小鼠鼻粘膜上皮细胞凋亡的影响，作者又对小鼠鼻组织中的凋亡蛋白进行了TUNEL染色和Western blot检测。与模型组相比，PNS-R1组鼻粘膜组织中TUNEL阳性凋亡细胞的比例降低，且凋亡蛋白的表达被抑制。表明PNS-R1对AR小鼠鼻组织具有抗凋亡作用。

图二：PNS-R1抑制AR小鼠鼻粘膜上皮细胞凋亡。

JC-1染色分析表明，PNS-R1处理可以恢复IL-13诱导的MMP丢失。与模型组相比，PNS-R1治疗也显著减弱了IL-13诱导的Cleaved-caspase-3、Bax、Cyt-c、Apaf-1和Cleaved-caspase-9的表达。流式细胞术也显示PNS-R1显著减少膜联蛋白V阳性凋亡细胞。在免疫荧光测定中Cleaved-caspase-3水平减少。以上结果表明，PNS-R1可以恢复IL-13诱导的MMP丢失，抑制细胞凋亡。

图三：PNS-R1恢复IL-13诱导的MMP丢失，减少HNEPCs细胞凋亡。

为了了解PNS-R1在IL-13诱导的线粒体功能障碍中的调节作用，作者检测了线粒体分裂蛋白（Drp1和Fis1）和融合蛋白（MFN2、MFN1和OPA1）的表达，以及Drp1在线粒体上的易位。如图所示，Drp1的总蛋白质丰度没有显著变化。然而，IL-13刺激增加了Drp1中Ser616的磷酸化，减弱了Drp1中Ser637的磷酸化，表明Drp1被激活。IL-13刺激降低MFN2表达，表明融合受到抑制。同样，IL-13刺激增加Fis1表达。相反，MFN1和OPA1没有显著变化。PNS-R1可逆转IL-13诱导的p-Drp1（Ser616）和Fis1的变化，而PNS-R1可进一步增加IL-13诱导的p-Drp1（Ser637）和MFN2的减少。进一步通过有丝分裂追踪红染色和Tom20检测进一步观察线粒体形态的变化。发现IL-13处理后的线粒体形态从高度动态的管状网络转变为碎片状或球形。而PNS-R1可逆转线粒体的形态学变化。PNS-R1减少了IL-13刺激的HNEpCs细胞中的Drp1易位。共定位分析表明，PNS-R1抑制Tom20和Drp1在鼻上皮细胞中的共定位，表明线粒体分裂受到抑制。上述结果表明，PNS-R1抑制线粒体分裂和Drp1易位，并部分促进线粒体融合，从而抑制线粒体功能障碍。

图四：PNS-R1调节线粒体分裂和融合。

活性氧的积累与线粒体损伤密切相关，在IL-13处理后，PNS-R1显著抑制HNEPC细胞中的ROS和mtROS生成。此外，还观察到PNS-R1治疗减少了AR小鼠鼻粘膜组织中ROS的产生。用DPI（细胞ROS抑制剂）和mito-TEMPO（mtROS抑制剂）效果和PNS-R1抑制Drp1易位的效果一样。这些结果表明，PNS-R1可以在体内和体外抑制活性氧的产生。

图五: PNS-R1减少活性氧的产生。

为了探讨PNS-R1对AMPK的调节作用，体外研究了PNS-R1处理对AMPK活性的影响。结果表明，PNS-R1显著增加了HNEPCs细胞中的AMPKα磷酸化。使用siRNA敲除AMPKα减弱了PNS-R1对p-Drp1（Ser616）的抑制，同时增强了其对p-Drp1（Ser637）的抑制。此外，AMPKα的敲除减弱了PNS-R1对IL-13诱导的HNEPCs细胞中Drp1易位的抑制作用。以上结果表明，PNS-R1可能通过AMPK介导Drp1诱导的HNEPCs细胞线粒体分裂和损伤。

图六：PNS-R1通过AMPK抑制线粒体分裂

为了探索PNS-R1的调节机制，我们研究了TXNIP/NLRP3信号通路中关键蛋白的变化，这。如图所示，IL-13激发后，HNEPCs细胞中TXNIP、NLRP3、Cleaved-caspase-1和IL-1β的水平显著升高，并被PNS-R1抑制。同时，线粒体分裂抑制剂Mdivi-1减弱了TXNIP和NLRP3的表达，表明该信号通路可由Drp1调节。类似地，PNS-R1也下调TXNIP和NLRP3的表达，表明信号通路可由PNS-R1调节。当AMPK被敲除时，PNS-R1对IL-13诱导的NLRP3和TXNIP表达的抑制作用显著减弱。此外，当TXNIP被敲除时，PNS-R1对NLPR3的抑制作用也显著增强。最后，IL-1β免疫荧光显示PNS-R1下调IL-1β表达.这些结果表明，PNS-R1可能通过影响AMPK/Drp1介导的线粒体分裂和TXNIP/NLRP3介导的炎症小体激活在AR中发挥作用。

图七：PNS-R1抑制IL-13诱导的TXNIP/NLRP3炎症体。

总之，这一结果发现PNS-R1作为AMPK的激动剂，通过抑制ROS生成和Drp1激活介导的线粒体分裂来保护线粒体完整性。此外，PNS-R1还抑制TXNIP/NLRP3炎症体激活，以减轻AR炎症反应。这些结果表明PNS-R1可以改善AR症状，可能是一种潜在的AR治疗剂。

DOI: 10.1016/j.bcp.2022.115106

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