羟基酪醇对自由基诱导的氧化性损伤的抑制作用

自由基产生于细胞呼吸和代谢过程中，是机体正常代谢产物，在体内有很强的氧化反应能力，易损害 DNA、蛋白质、脂质和线粒体，从而引起机体的损伤。自由基诱导的氧化性损伤与许多慢性疾病，如癌症、心脑血管疾病、神经退行性疾病和细胞衰老等有关[1]。为了缓解自由基对人体的危害，许多天然抗氧化剂如维生素 E (α-生育酚)、白藜芦醇、β-胡萝卜素等被用于自由基的清除。因此，探索一些能够切断过氧化链式反应的抗氧化剂来抑制机体的自由基损伤已成为一种必要的趋势。

和一些其他西方国家相比，地中海周边国家的人们患癌症和心脑血管疾病的几率要低很多，而这就要归功于著名的“地中海饮食”[3]。由于地中海饮食带来了诸多益处，从而使其被广泛地关注。典型的地中海饮食包括：小麦、橄榄油和葡萄[4]。大量研究表明葡萄中的活性成分白藜芦醇(resveratrol)及其它多酚类化合物具有显著的生物活性。而羟基酪醇(hydroxytyrosol，如图 1)作为橄榄油中的主要活性成分也正日益引起大家的关注[5]。羟基酪醇大量存在于橄榄的果实和枝叶中，是橄榄油中一种重要的天然多酚类化合物。多方面研究表明，羟基酪醇具有非常好的生物活性，尤其在抗氧化方面有着显著的作用。

DPPH 自由基和 ABTS.+自由基均是很稳定的自由基，常被用来检测某种抗氧化剂清除自由基的能力。水溶性的偶氮化合物 2,2’-偶氮二(2-眯基丙烷)二盐酸盐(AAPH) 在生理温度下通过热分解而产生自由基，这些自由基能够进攻蛋白质或脂类引发过氧化反应并最终导致氧化损伤。红细胞(RBC)膜富含不饱和脂肪酸, 这些不饱和脂肪酸对自由基诱导的过氧化反应非常敏感，可使红细胞溶血[6]。由于 AAPH 产生自由基的速率很容易控制和测量, 因此利用 AAPH 诱发红细胞溶血能够为进行自由基引发的膜损伤提供一个很好的研究方法[7]。除此之外，丙二醛(malonaldehyde, MDA)作为脂质过氧化的产物，也是一个判断氧化损伤程度的重要标志物[8]。本文先检测 羟基酪醇 清除 DPPH 和 ABTS.+ 两种自由基的能力，然后检测 羟基酪醇对 AAPH 诱导的红细胞溶血以及红细胞膜的氧化性损伤的保护作用，从而来证实羟基酪醇的抗氧化作用。

1. 实验方法

1.1自由基清除实验

DPPH 自由基的清除实验[10]：先将不同浓度的 羟基酪醇 和 DPPH 溶液混合，羟基酪醇 的反应终浓度分别为 10、20、30、40、50 µM，DPPH 在体系中的浓度为 5×10-5 M。混匀后避光放置 30min，直至其吸光度值稳定。最后用紫外分光光度计测定反应液在 517 nm 处的吸光度。清除率% = ( Ac − As) / Ac× 100%。As 和 Ac分别代表药物作用组和对照组，白藜芦醇为阳性对照班。

ABTS.+自由基的清除实验[11]：先将不同浓度的羟基酪醇和ABTS.+溶液混合，羟基酪醇的反应终浓度分别为 1、3、5、10、20 µM，ABTS.+在体系中的浓度约为 140 mM。混匀后避光放置 30min，直至其吸光度值稳定。最后用紫外分光光度计测定反应液在 734 nm 处的吸光度。清除率% = ( Ac − As) / Ac× 100%. As 和 Ac分别代表药物作用组和对照组，白藜芦醇为阳性对照班。

1.2 红细胞溶血试验

红细胞的处理：人血红细胞来自甘肃省兰州市红十字会血液中心。先取出 10 mL 的红细胞，向其加 10 mL 的 0.15 M 的 NaCl 溶液，摇匀，2000 r/min 的转速离心，不断重复，直至离心后上清基本澄清。最后，吸掉上清，用 0.15 M 的 NaCl 溶液将红细胞稀释 10 倍，即红细胞的浓度为 10 %。

溶血实验[12]：用 pH=7.4 的 PBS 将红细胞配成浓度为 5 %的红细胞悬浮液，于 37℃温育5 min，然后加入适量的 AAPH 水溶液引发溶血，温育期间反应混合液轻轻摇动。在 30 min或 60 min 的时间间隔后先离心，再取出 100 µL 反应液, 用 900 µL 0.15 mol/L NaCl 稀释, 混匀后取上层清液在酶标仪上测其在 540 nm 处吸光值 A1;同样地取出适量的反应混合液，用蒸馏水稀释使红细胞完全溶血，同样条件下离心后在 540 nm 处测其吸光值 A2，百分溶血度等于(A1 / A2 )×100。在抗氧化实验中抗氧化剂 羟基酪醇 在 AAPH 加人以前先加人并且温育。

1.3 TBARS 法检测 MDA

红细胞膜的制备：首先用 10 倍体积 pH=7.4 的 PBS 缓冲溶液将红细胞重复洗涤三次，每次离心分离后小心除去上清液及暗黄色沉淀表层。然后用 30 倍体积预冷的 5 mmol/L 低渗磷酸盐缓冲溶液(pH=7.6)使红细胞完全溶血，离心分离并洗涤后得到白色的红细胞膜。红细胞膜中的蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。

TBARS 实验[13]：将红细胞膜悬浮在 pH=7.4 的 PBS 中，并恒温在 37℃，然后向红细胞膜中加抗氧化剂和 AAPH。隔上约10 min取出100 µL 反应液，加入250 µL溶液 A，于振荡器上混匀，置于90℃加热器30 min，待冷却后，取上清液在分光光度计上测 532 nm 处吸光度。用10 nmol/ml 四乙氧基丙烷作为标准物。

1.4 蛋白氧化的测定

将 BSA 作为蛋白氧化的模型[14]。损伤模型反应体系包括：0.18mg/ml 的 BSA，0～50mM的 AAPH，二者在 37℃水浴中作用 1 h 后，在反应混合物中加含有 0.1 %B羟基酪醇 的 4×LoadingBuffer(B羟基酪醇 用于阻止过氧自由基的进一步形成)，100℃煮沸 5min 后，在 12 %的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳 3 h。凝胶在 0.05%的考马斯亮蓝 R-250 中染色，然后脱色拍照。在抗氧化实验中抗氧化剂 羟基酪醇 与AAPH 一起加入反应体系37℃温育。

2. 结果与讨论

2.1 羟基酪醇 对 DPPH 和 ABTS.+两种自由基的清除能力

DPPH 自由基 (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，乙醇溶液呈紫色，在 517 nm 处有强吸收峰。如图 2A 所示，随着 羟基酪醇 浓度的增大，清除 DPPH自由基的能力越强，当 羟基酪醇 的浓度为 40 µM 时，清除率可达 90%。结果同样表明，随着白藜芦醇(Res)浓度的增大，清除 DPPH 自由基的能力也越强，但 Res 的清除效果远不及 羟基酪醇。ABTS 在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的 ABTS.+，在 734 nm 处有吸收，当有抗氧化物存在时吸收会减弱。如图 2B 所示，羟基酪醇 对 ABTS.+有一定的清除能力。随着 羟基酪醇 浓度的增大，清除 ABTS.+自由基的能力越强，具有较好的浓度依赖关系当 羟基酪醇 的浓度为 20 µM 时，清除率可达 90%。同样，随着 Res 浓度的增大，清除 ABTS.+自由基的能力也越强，虽然 羟基酪醇的清除效果不及 Res，但其效果也很好。

2.2 羟基酪醇 对 AAPH 诱导的红细胞溶血的抑制作用

AAPH 在红细胞的水分散溶液中经热分解可引发产生自由基 (R·)，它可以进攻红细胞膜中的不饱和脂肪酸 (LH)，从而引发脂质过氧化((1)~(4)式)。在37℃的水分散溶液中AAPH 的引发速率是 1.3×10-6 [AAPH] /s[15]。由于脂质过氧化是一个自由基链式反应，一个自由基能够引发多达 20 个链增长反应[15]，因此红细胞膜会被迅速破坏而导致溶血。

图 3 为在 37℃水浴中 AAPH 诱导的红细胞溶血。3f 为不加 AAPH 的情况下，可以看出红细胞是稳定的，在 4 h 之内基本没有溶血发生。3a 为加入 AAPH 后，经过一定的抑制期后，红细胞快速溶血，在 2 h 内溶血达到一个平台。这个抑制期应该是由红细胞本身所含有的生物抗氧化剂，如维生素 E 和泛氢醒-10 所造成的[16]，因为在胶束模拟体系中加入AAPH时并没有观察到抑制期[17]。从图 3c、3d、3e 可以看出，向反应体系中加入 羟基酪醇 后溶血的速率减慢，减慢的速度随着 羟基酪醇 浓度的增加而升高。3b 为加入 Res 后的溶血曲线，可以看出，Res 有一定的抗溶血作用，但效果不及 羟基酪醇。总体结果表明，羟基酪醇 拥有相当优异的抗 AAPH诱发的红细胞溶血作用，具有很好的浓度依赖关系，并且效果远优于阳性药物 Res。

图 3 37℃水浴中 AAPH 诱导的 5%人血红细胞在 0.15 mol/L PBS (pH=7.4)中的溶血曲线。

2.3 羟基酪醇 对 AAPH 诱导的红细胞膜过氧化的抑制作用

当红细胞膜与 AAPH 作用时，膜上的脂质、蛋白质会被 AAPH 热分解产生的自由基氧化破坏，MDA 是膜遭氧化后的产物，因此检测 MDA 的生成量是一种有效地判断氧化损伤程度的方法。本次实验采用硫代巴比妥酸反应物法(TBARS)，即硫代巴比妥酸与 MDA作用生成一种粉红色产物，此化合物在 532 nm 处有最大吸收。如图 4a，在不加抗氧化剂只加AAPH 的情况下，可以看出 TBARS 值升高的比较快。从图 3b、3d、3e 可以看出,向反应体系中加入 羟基酪醇 后 TBARS 值升高的速率减慢，减慢的速度随着 羟基酪醇 浓度的增加而升高。3b 为加入 Res 后的溶血曲线，可以看出，Res 有一定的抗氧化作用，但效果不及 羟基酪醇。

图 4 37℃水浴 AAPH 诱导的红细胞膜在 0.15 mol/L PBS (pH=7.4)中的溶血曲线。

2.4 羟基酪醇 对 AAPH 诱导的 BSA 氧化性损伤的保护作用

从图 5A 我们可以看出，BSA 与 AAPH 在 37℃水浴中作用 1 h 后，用 SDS-PAGE 电泳观察到，随着 AAPH 浓度的增加 BSA 的条带亮度逐渐变暗，即 BSA 逐渐降解。如图 5B，当向体系加入不同浓度的 羟基酪醇 后，可以看出，随着 羟基酪醇 浓度的逐渐增加，BSA 的降解会被抑制，并有一定的浓度依赖性。根据条带的浓度可以看出，相同浓度下(20 µM)，羟基酪醇 对 AAPH诱导的 BSA 氧化性损伤的保护作用要优于 Res。

图 5 SDS-PAGE 检测 羟基酪醇 对 AAPH 诱导的 BSA 氧化性损伤的保护。

由以上所有结果可以得出，羟基酪醇 在清除自由基方面有非常好的效果。和 Res 相比较，羟基酪醇 清除 ABTS.+自由基的能力弱于 Res，但清除 DPPH 自由基的能力优于 Res，这可能与抗氧化剂和自由基作用的机制有关。抗氧化剂使自由基失活主要基于两种机制：电子转移(ET)和氢质子转移(HAT)。在实验体系中，ET 与 HAT 可以同时发生，主反应机制由抗氧化剂的结构、性质、溶解性、分配系数、溶剂系统决定。HAT 通常快速，在分秒内就能完成;ET通常较慢，完成反应需要较长时间[18]。ABTS.+自由基由强氧化剂与 ABTS 盐反应产生，DPPH则是一类较稳定的自由基[19]。ABTS+·的氧化还原电势为 0.68V[20]，只要化合物的氧化还原电势低于 0.68V，就能将 ABTS.+还原，导致体系绿色减退。

同时，ABTS.+又是一类可以通过 HAT 机制导致体系绿色减退的自由基。和 羟基酪醇 相比较，Res 结构上的酚羟基多一些，所以，Res 是一种更好的供氢抗氧化剂，使其在清除 ABTS.+自由基时效果要优于羟基酪醇。DPPH也并非是纯粹的 ET 反应，在反应体系中，也会伴随 HAT 机制，决定反应的主要因素是空间位阻效应，空间位阻大的抗氧化剂与 DPPH 较难反应，反应机制可能与空间位阻小的抗氧化剂不同，反应达到平衡的时间也较长[18]，因而，在清除 DPPH 自由基时空间位阻小的 羟基酪醇要优于空间位阻大的 Res。

氧化应激(Oxidative stress)是指生物体内 ROS 或者活性氮物种 (Reactive nitrogenspecies, RNS)的生成超出了机体对它们的清除能力，从而对生物体造成氧化性损伤。已有很多证据支持氧化应激与多种疾病如肿瘤、炎症、衰老、神经退行性疾病、心脑血管疾病等有着密切关系[21]。对抗氧化应激的有效途径之一就是补充各类抗氧化剂。由于羟基酪醇具有优越的抗氧化性能，其抗氧化活性有可能是其抗炎活性、抗肿瘤活性以及抗心脑血管疾病等功能的分子基础。

羟基酪醇的药理作用已不断被证实，而其作用机理也逐渐被发掘。羟基酪醇具有邻二羟基的结构，通常具有这一结构的化合物都具有较高的抗氧化活性[22]。这是由于：1)苯环上羟基处在邻位时，可以增加羟基上的电子云密度，降低 O-H 键能，使得酚羟基上夺氢反应容易发生;2)苯环上羟基处在邻位时，可以使其发生夺氢反应后生成的酚氧自由基的单电子离域到整个体系，同时可以被进一步氧化生成邻醌或对醌(图 6);3)具有邻二酚羟基的化合物的酚羟基氢被自由基夺取后可与其邻位羟基形成分子内氢键，这同样可以稳定生成的自由基(图 6)。

图 6 具有邻二羟基结构的 羟基酪醇 可能的抗氧化作用机制

3. 结论

羟基酪醇作为橄榄油里的一个主要活性物质，在清除自由基方面有卓越的作用，并且可以抑制自由基诱导的人血红细胞的氧化性溶血、红细胞膜的氧化损伤以及 BSA 氧化性损伤。正如姜黄素(curcumin)、白藜芦醇一样，它在抗炎、抗癌、抗心脑血管疾病以及抗氧化等方面的作用已逐渐被挖掘，羟基酪醇也是一种来源于食用植物的天然化合物，这对于羟基酪醇在食品添加剂、化妆品、保健食品和医药方面的开发和利用提供了良好的理论依据。

由于羟基酪醇结构简单，因而对其开展化学修饰以及相关的化学生物学研究具有很大的潜力及可行性。通过研究羟基酪醇与各类可能靶点分子的作用，进而阐述其作用机制将会是今后认识羟基酪醇各类生物活性的重要手段，同时也将为基于羟基酪醇的化学结构修饰指明方向。我们期待能够对羟基酪醇进行更为深入的生物活性机制研究以及发展出基于羟基酪醇结构的具有更好生物活性的小分子化合物，同时进一步开发出羟基酪醇和其衍生物更多应用价值。