绿原酸标准曲线的绘制

一、实验目的

1. 1   熟练掌握 用高效液相色谱仪测绿原酸含量的方法，绘制标准曲线；
1. 2   熟练掌握 用紫外分光光度仪测绿原酸含量的方法，绘制标准曲线；

二、原理

2.1  绿原酸简介
绿原酸 (chlorogenic acid) 是由咖啡酸 (caffeic acid) 与奎尼酸 ( 鸡纳酸 ,quinic acid, 即 1- 羟基六氢没食子酸 ) 组成的缩酚酸 , 异名咖啡鞣酸 , 化学名 3-O- 咖啡酰奎尼酸 (3-O-caf-feoylquinic acid), 分子式 :C 16 H 18 O 9 , 分子量 :345.30 ， 是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途 径产生的一种苯丙素类化合物 。
2.2  高效液相色谱仪的工作原理：
高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统 , 样品溶液经进样器进入流动相 , 被流动相载入色谱柱 ( 固定相 )  内 ,  由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数 ,  在两相中作相对运动时 ,  经过反复多次的吸附 -  解吸的分配过程 ,  各组分在移动速度上产生较大的差别 ,  被分离成单个组分依次从柱内流出 ,  通过检测器时 ,  样品浓度被转换成电信号传送到记录仪 , 数据以图谱形式打印出来。

三、试剂与仪器

3.1  材料与试剂 ：绿原酸标准品；乙腈为色谱纯试剂，磷酸、甲醇、乙醇 等试剂均为分析纯 ；
3.2  主要仪器 ：高效液相色谱仪，分析天平， 25ml 、 50ml 棕色容量瓶，滴定管， 10ml,25ml,50ml,100ml 容量瓶各 7 个， 1ml 、 2ml 、 5ml 的移液管，紫外分光光度仪，比色皿；擦镜纸；注射器。

四、实验步骤

4.1  用 紫外分光光度法 所测的绿原酸标准曲线
紫外分光光度法 ： 精密称取绿原酸标准品 0.0055g ，用 80% 的乙醇溶解，转移到 100ml 容量瓶中，加 80% 乙醇到刻度，混匀，制得标准母液。精密吸取 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 、 6.0 、 7.0 、 8.0 、 9.0 、 10.0ml 于 25ml 容量瓶中，加 80% 乙醇到刻度，混匀，此为标准系列溶液。将标准溶液在 200 ～ 400nm 波长范围内扫描，测定绿原酸的最大吸收波长，在最大波长处测定吸光度。以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出相应的回归方程。
4.2  用高效液相色谱仪所测的绿原酸标准曲线
高效液相色谱法 ( 本方法参照《中国药典 ( 2005  版 )  》 )  。色谱柱 : C18ODS( 250 mm   × 4.  6 mm , 5 μ m) ; 流动相 : 乙腈 20. 4% 磷酸溶液 (13z 87) ; 检测波长为 327 nm; 柱温 :  20 ℃ ; 进样量 : 10 μ L 。标准曲线制备 : 准确称取绿原酸对照品 20 mg, 置 50 mL 棕色容量瓶中 , 加 60% 甲醇适量 , 超声溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 分别准确移取 1 mL 、 2 mL 、 3 mL 、 4 mL 、 5 mL 、 6 mL 、 7 mL, 置 25 mL 棕色容量瓶中 , 用 60% 甲醇溶解并稀释至刻度 , 得一系列绿原酸标准溶液 , 按上述色谱条件 , 进样 10  μ L,  测定峰面积 ,  以峰面积积分值 (Y) 为纵坐标、绿原酸含量 (X) 为横坐标绘制标准工作曲线 , 计算并得回归方程。

五．结果与讨论  

5.1 用 紫外分光光度法 所测的绿原酸标准曲线
5.1.1 绿原酸标准品的波长扫描
绿原酸标准品的波长扫描如下图所示，可知绿原酸的最大波长为 328nm 。

5.1.2 由定量测量所得的绿原酸的浓度和吸光度的关系
如下表所示：

浓度 ug/ml	4.4	6.6	8.8	11	13.2	15.4	17.6	19.8	22
吸光度 A	0.2217	0.3155	0.4136	0.4983	0.6135	0 .7221	0.8239	0.9086	1.0362

由此可绘制绿原酸标准曲线 ， 如下 图 所示 ：

以杜仲绿原酸标准溶液的浓度和吸光度进行线性回归，得回归方程 y=0.0461x+0.0089,R 2 =0.9987 。表明绿原酸含量在 4.4-22ug/ml 范围内与吸光度线性关系良好。
4.2  用高效液相色谱仪所测的绿原酸标准曲线
4.2.1   测量所得的绿原酸的浓度和锋面积的关系
如下表 2 所示 ：

浓度 ug/ml	16	32	48	64	80	96	112
峰面积 m 2	207389	698949	1139087	1610034	2168360	2762896	3227387

表 2  绿原酸的浓度和锋面积的关系
4.2.2   绿原酸标准品的色谱图

图 3  绿原酸标准品的色谱图
 
4.2.3 绘制绿原酸标准曲线
如下 图 4 所示 ：

图 4  绿原酸标准曲线

以杜仲绿原酸标准溶液的浓度和峰面积进行线性回归，得回归方程 y=31742x-337890,R 2 =0.9986 。表明绿原酸含量在 16-112ug/ml 范围内与峰面积线性关系良好。
六 .  总结
通过 紫外分光光度法可知：
(1)  绿原酸的最大波长为 328nm;  
(2)  其以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出相应的回归方程为： y=0.0461x+0.0089 R 2 =0.9987
通过高效液相色谱法可知：
以峰面积积分值 (Y) 为纵坐标、绿原酸含量 (X) 为横坐标绘制标准工作曲线 , 计算并得的回归方程为： y=28698x-183879 R 2 =0.9985