苦豆籽生物碱的提取工艺

苦豆子（ Sophora alopecuroides L. ）又称苦甘草、苦豆根，隶属于豆科槐属，为多年生草本、根茎地下芽植物，其分布区较广，在我国主产于宁夏、内蒙古、山西、陕西、甘肃等地区 [1-2] 。苦豆籽是苦豆子的成熟种子，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用，广泛应用于医药、植物生长调节剂、饲料业等领域 [3] 。苦豆籽中的生物碱含量约为 8.11% ，主要含氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱、槐定碱等 20 多种单一生物碱 [4] 。目前在临床上应用苦豆籽浸膏片、苦豆碱治疗急性菌痢，用槐定碱和苦豆籽总碱注射液治疗肿瘤的研究已经进行得较为成功。国内外文献中关于苦豆籽生物碱的报道主要集中在成分分析和检测 [5] ，而以苦豆籽作为试验材料并从中提取生物碱的报道很少，加上常规提取方法效率低、应用局限性大，因此生产应用价值不高 [6] 。本研究采用回流提取技术，通过正交试验法对影响生物碱提取率的因素进行优化并选出最佳工艺条件，以期为今后从苦豆籽中获得生物碱的研究和产业化生产提供科学依据与参考。

 

 1 材料与方法

        1.1 仪器与材料

         所用的仪器主要有： TU-1810 型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司； DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱，郑州南北仪器设备有限公司； AE240 电子分析天平，梅特勒 - 托利多仪器（上海）有限公司； DKB-8A  电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司； 130-A  型高速粉碎机，长沙市中南制药机械厂。

         材料与试剂主要有：苦豆籽，采于盐池县花马池镇德胜墩自然村等地，经宁夏药品检验所邢世瑞主任药师鉴定为豆科槐属植物苦豆子种子，粉碎过 20 目筛待用；乙醇、氯仿等化学试剂均为分析纯。

        1.2 试验方法

        1.2.1 苦豆籽生物碱含量的测定   苦豆籽总生物碱中含 20 多种单体，其中以槐定碱的含量最高，因此参考相关文献，以槐定碱为指标成分，采用溴麝香草酚蓝比色法测定苦豆籽总生物碱含量（ λ=410 nm ） [7] ，具体方法如下。

        1.2.1.1 标准曲线的制作精确称取 5.00 mg 槐定碱对照品置于 5 mL 容量瓶中，加无水乙醇溶解、稀释并定容，摇匀即得槐定碱对照液。分别取 0 、 20 、 40 、 60 、 80 、 100 、 120 、 140 μL 上述溶液于 50 mL 的磨口锥形瓶中，使乙醇挥发后分别加入 12 mL pH 值为 7.6 的溴麝香草酚蓝缓冲液、 12 mL 氯仿，密塞剧烈振摇 2 min 后静置 2 h ，分取氯仿层，以第 1 组为空白对照，于 410 nm 处测定提取液的吸光度，以吸光度为横坐标、氯仿层浓度为纵坐标得回归方程： C=76.92D+0.77 ， r=0999 0 。

        1.2.1.2 样品含量的测定分别吸取 1 mL 定容的提取液并稀释至 100 mL ，再吸取 1 mL 稀释液至锥形瓶中，分别加入  12 mL pH 值为 7.6 的溴麝香草酚蓝缓冲液、 12 mL 氯仿，密塞振摇 2 min 后注入酸式滴定管中，静置 2 h ，分取氯仿层。以  1 mL  对应的提取溶剂、 12 mL pH 值为 7.6 的溴麝香草酚蓝缓冲液、 12 mL 氯仿进行同比操作，设为空白对照，于 410 nm 处测定提取液的吸光度 D ，从制作的标准曲线中查得相应的生物碱浓度，计算出苦豆籽总生物碱的含量。

        1.2.2 最佳提取溶剂的确定准确称取 3 份苦豆籽粉，每份 25.0 g ，在其他条件相同的情况下，分别用 200 mL 水、 0.4% 盐酸、 65% 乙醇各进行回流提取 6 h ，过滤后收集滤液并定容至 200 mL ，用溴麝香草酚蓝比色法测定生物碱含量并计算生物碱提取率，确定最佳的提取溶剂。

        1.3 单因素试验

        1.3.1 料液比分别准确称取 4 份 25.0 g 的苦豆籽粉并置于三角瓶中，再分别加入 100 、 200 、 400 、 800 mL 65% 乙醇，浸泡过夜后将其移至烧瓶中进行回流提取 6 h ，过滤、定容作为提取液。按照 “1.2.1” 中苦豆籽生物碱含量测定方法测得生物碱提取率。试验重复 3 次，取平均值。

        1.3.2 提取时间准确称取 5 份 25.0 g 苦豆籽粉，分别置于三角瓶中，分别各加入 200 mL 65% 乙醇，浸泡过夜后将其移至烧瓶中分别回流提取 2 、 4 、 6 、 8 、 10 h ，过滤，定容作为提取液。按照 “1.2.1” 中苦豆籽生物碱含量测定方法测得生物碱提取率。试验重复 3 次，取平均值。

        1.3.3 溶剂 pH 值准确称取 5 份 25.0 g 的苦豆籽粉，分别置于三角瓶中，分别加入 pH 值分别为 1 、 2 、 3 、 4 、 5 的 65% 乙醇 200 mL ，浸泡过夜后，将其移至烧瓶中分别回流提取 6 h ，过滤，定容作为提取液。按照 “1.2.1” 中苦豆籽生物碱含量测定方法测得生物碱提取率。试验重复 3 次，取平均值。

        1.4 正交试验设计

         准确称取 9 份苦豆籽粉，每份 25.0 g ，根据单因素试验结果，以料液比、溶剂浓度、溶剂 pH 值、提取时间这 4 个因素做正交试验，设计 L9 （ 34 ）正交试验。根据试验结果确定最佳的提取条件。

        2 结果与分析

        2.1 最佳提取溶剂的确定

         提取溶剂对苦豆籽生物碱提取率的影响见表 1 ，可以看出 65% 乙醇作为溶剂的提取率较高，达到 3.43% ，因此选 65% 乙醇作为溶剂进行回流提取，选择 55% 、 65% 、 75% 作为正交试验的 3 个溶剂浓度。

         最佳提取溶剂的确定

         溶剂提取率（ % ）水 2.630.4%  盐酸 2.8165%  乙醇 3.43

        2.2 料液比对苦豆籽生物碱提取的影响

         料液比对苦豆籽生物碱提取率的影响见图 1 ，可以看出，提取率随料液比的增大而增加，当料液比达到 1 g ∶16 mL 时，苦豆籽中的生物碱基本溶出，随着溶剂用量的进一步增加，提取率反而会明显下降。因此选择料液比 1 g ∶16 mL 、 1 g ∶20 mL 、 1 g ∶24 mL 作为正交试验的 3 个考察水平。

        2.3 提取时间对苦豆籽生物碱提取的影响

         随着提取时间的增加，提取率逐渐增加，其中 4 h 的提取率最高，而后渐渐降低，综合考虑提取率和效率，选择 3 、 4 、 5 h 3 个水平进行正交试验。

        2.4 溶剂 pH 值对苦豆籽生物碱提取的影响

         溶剂 pH 值对苦豆籽生物碱提取的影响结果见图 3 ，可以看出，苦豆籽生物碱的提取率随着溶剂 pH 值的增加有一定的提高， pH 值为 4 时的提取率最高，而后随着 pH 值增加，提取率下降。因此选择 pH 值 3.5 、 4.0 、 4. 5 作为正交试验的 3 个考察水平。

        2.5 正交试验结果

         根据所选取的因素水平，采用 L9 （ 34 ）正交表进行试验设

         计，对结果进行极差分析试验结果表明： 4 个因素对提取率的影响主次顺序为 A>D>C>B 。得出最佳的提取工艺条件是： A1B3C1D1 ，其中最优的 B 因素为 75% 乙醇，但考虑工业化生产中的安全性及成本，选择最优工艺条件为： A1B1C1D1 ，即 55% 乙醇，料液比 1 g ∶16 mL ，溶剂 pH 值 =35 ，提取时间 3 h 。

        2.6 验证性试验

         按照以上正交试验所确定的最佳提取工艺重复提取 3 次，计算提取率，结果分别为 4.57 % 、 4.61 % 、 4.58 % ，均大于表 3 中的提取率，表明以上正交试验所确定的提取工艺为最佳提取工艺。

        3 结论与讨论

         对苦豆籽生物碱进行吸收波长扫描发现，其最大吸收波长为 410 nm 。采用单因素试验和正交试验法确定了最佳的提取条件为：料液比 1 g ∶16 mL ，提取溶剂为 55% 乙醇，溶剂 pH 值为 3.5 ，提取时间 3 h 。工艺验证试验表明，最佳工艺的提取得率高、稳定性好，且工艺操作容易控制，为进一步放大进行工业化生产提供了条件 [8] 。

         笔者在预试验中考察了用 65% 乙醇进行超声、回流、煎煮提取，结果显示超声和回流提取法较煎煮法提取效率高，且超声提取的提取率最高达 4.7% ，但是由于超声提取法在工业生产中设备较少且较贵，目前较少有工业化的超声提取设备，大部分企业以回流提取为主，故本研究最终确定用回流法提取总生物碱为考察指标对提取工艺进行优选，筛选得到的工艺条件经验证表明方法可行、重复性较好 [9-10] 。

         参考文献：

        [1] 李春英，胡永强 .  苦豆子中生物碱的分布及其在生长期内的含量变化 [J].  植物生理学通讯， 2009 ， 45 （ 9 ）： 910-912.

        [2]Haug G ， Hoffmann H. Chemistry of plant protection[M]. Berlin ： Springer Verlag ， 1986.

        [3] 秦学功，元英进 .  苦豆子生物碱的研究与苦豆子综合利用 [J].  中国野生植物资源， 2000 ， 19 （ 4 ）： 30-32.

        [4] 史高峰，张梅，陈学福，等 .  正交实验法优选苦豆籽总生物碱的纯化工艺 [J].  应用化工， 2011 ， 40 （ 10 ）： 1774-1778.

        [5] 杨巧丽，顾政一，黄华 .  中药苦豆子的研究进展 [J].  西北药学杂志， 2011 ， 26 （ 3 ）： 232-236.

        [6] 贾晓红，尚军，余永婷，等 .  苦豆籽中苦参碱的提取条件的优化选择 [J].  食品科技， 2005 （ 4 ）： 39-42.